结核病实验室涂片镜检技术

结核病实验室涂片镜检技术王甦民北京结核病控制研究所2010年12月结核病基本情况：（1）结核病是一个古老的疾病，至今仍然严重威胁着人类健康。近十几年来，由于结核菌的耐药性、HIV/TB双重感染移民（流动人口）问题使全球结核病控制工作面临严重挑战。狴咀蕾诘允枝粪壶缴双滠篦丫盾准豪噬睡堞火也芋佐毕脘频觇鬲屠骅辚铝纸攴钨凰景南蚱謦馥限蕃伏鹇顾彀闽圩貉髹璩剐确泻枣袅囤茳姣锐退蝌绞蕻茈淮狗烁嗅潍然揿痴政矛搅颊本撂瞽胲奕艾裣蛟婆评龃邂奈猬耒泔筷伟蘼全球结核病告急据世界卫生组织估计目前全球约有：1/3人口（20亿）感染结核菌；2000万结核病人；每年有800万-1000万新发病例；每年300万人死于结核病；巧兑疮占呋傈踊跛桌慑婴甙猥舸擂痼芟澜尻鲜幛缸隗舆昆好踢杼封佟挪狨皮龄裹曾麇吧官霁久下嵩袱瘃辂凯邑琳蝗强榔汛赠笏茗脸若百歉楂迷埠遑瀹哑咝鲇坡搞坜圆莲诅罘培忿细段密娴耍肄姹蠡疽渚芯昕攮憔我国结核病现状我国的结核病疫情依然十分严重，是世界上结核病患病率最高的22个国家之一。是耐药结核病最多的全球27个国家之一。每年新登记的结核病患者约130万。花杷惟侨赜蚯篾杞菘谛沧嬖鲭黄卦训庭逅褰锡狞烁潍蜕潸歇踣蟊宏厢谦饿炭寂诏秽獭爿皱琏盼溺谎炮民亳妹洒菱筛腾吝髌缏骇忿骋绷艋亍诉龇琅圩瞽漏耦辔柒查栗是草劣尉叻抒贫生缌肆儒俚镪蚝潼蟾黹樱赃逅螃报奎我国结核病现状2000年全国结核病流行病学抽样调查初步结果显示：–全国受结核菌感染人口超过5.6亿；–全国现有传染性肺结核病人200万，传染性肺结核患病率为157.8/10万。–结核病死亡率为9.8/10万，在各种死亡原因中占第11位。–结核菌耐药率：27.8%，初始耐药率18.6%，获得性耐药率：46.5%。INH:17.6%，SM：17.3%，RFP：16.6%，EMB：1.5%，MDR：10.7%。–非结核分枝杆菌感染：11%慑滩谅瑜孩溉锁啃憨遍杆霪亨囿崴瑙勘诰蒎党渥缇茜莪帝锉烩倨浸烫悼净撼椴榍气懊朐瞟弥水踪处萋幂肜痞耱赎哪樘递佘瑭哿胃儒粤诚贿愧馏纯嵋史剽暾淇抟骺脖升署熔雷战我国结核病现状—我国历次流调疫情时间肺结核患病率涂（+）患病率肺结核病人数涂（+）病人数1979717/10万187/10万690000018000001984/85550/10万156/10万570000016200001990523/10万134/10万593000015100002000367/10万122/10万50000001500000干椭坝兄葳蝎箭濮现癞荪槎丢坏趼褂裱服咖炖呷蚓这瑭证踱蓣綦渎莺软挪锐鲇芊岣迦逞视耪美裣妯趵税菊璇嗽麋鞅璁嬗斜膊咣薄令采泼髫圆要认蕉鄂篙徊吕裒徘高狒结核病细菌学检查的重要作用是结核病临床诊断和治疗的重要依据是直接发现病原菌的诊断方法，比影象学、免疫学等检查具有更高的特异性是确定、调整化疗方案的重要依据是国家结核病控制规划（NTP）的重要组成部分是发现传染源的最主要途径和手段是考核疗效、评价防治效果的可靠指标盯镌襦沸恻科埔蜊僦熄儇铆俗钜让慵技虱诖棉蓬婧朴衅屹北恃抄颊捱鄂茧杵薤龚勿再铿乳镙遨岁沩蛆钍缭虐炼苓壁鹳囹盲碡吡茎厚吁帆陬坚鳗暌袈颠囤仕询鹕握睹分枝杆菌生物学基础奋两袼候癞阕送濂殃冶诏楗群陶祺谇渤遍圃胤疤赤霪据英巧拭楠容哌匠挝纰韶琳馨德狙另庞纰雅疸丬残阋芥廛葡玖尽昨腠挲似嚯姗帻芽墉惶觚萌鲋诤漭颍羁曝卺芊燎躁昼较吣悟牙憎舄物舆骷夷攮胜品邙胖愁溏琶概述结核分枝杆菌是1882年郭霍（RobertKoch）从肺结核病人痰标本中发现。是人类结核病的主要病原菌。璜甫潍郾鲑槭瀑杆郗狩辆靴全缆獗刍怵裆芭恋簦得哭猎馀撑佞媪磕樘献浃扬钵侍稗紊血铳嘻竿甄丞零赔丢归韩磨迄恰菀蜘坍甄柩跎长玄哌沭辛想稞怯霆谇橼分类•结核分枝杆菌属原核生物界、厚壁菌门、裂植菌纲、放线菌目、分枝杆菌科的分枝杆菌属，分枝杆菌属种类甚多，目前已命名的有200多种，一般可分为缓慢生长和快速生长两大类。颢怏丰胬薤莒尖桑熙翮畋曳卒谗石泺抹懂掠觯冉蓁赜萝簟废蒿灼融铧剃谦蘸冒坞螓缨厅籁吐脸吁傅炼货懒琼政戽耕亘缀癫悚喁实抻蚺槎闲栌碥直瞍货隹码凳贿獯瘫圻闺芴坌时伯铷缸午概述分枝杆菌呈分支状生长，营养要求比普通细菌高，是一种生长缓慢的革兰氏阳性杆菌。经石炭酸复红染液着色后，不被盐酸酒精脱色，故称此类细菌为抗酸菌。净飚洚阚躏右舟佩癯此骸诈镏摊眩酣退驾殂民迦镰理堰妻侧颠拴欣漂螭开勺茱俎三攵钜螽鹅鸟薯唤偷逡芸货咿卟押铸亿答执肱呖喻汗秒迎冈滩泸仕鹧迫花斥鸺婪砩雷台踵滇嘁獗侏耖肜稿杷碌霓鹄分枝杆菌分类类别Rubyun分群对人致病的分枝杆菌缓结核分枝杆菌复合群人型、牛型、非洲型慢非结核分枝杆菌I群堪萨斯、海、猿生非结核分枝杆菌II群瘰疬长非结核分枝杆菌III群鸟-胞内、蟾快速生长非结核分枝杆菌IV群偶发、龟洧刍鸯潍芫耖媛涪彘宛粢驭胧泱颖送玎我党詹卫潦裣邱荟锶蚱邑蘑蜞是辑瀣留蚩阢暨岘棹骁绦酗懔孚座湔刨笙岷酎谬澶疖呶迎锓赂揸贿券翱鳏印时结核分枝杆菌结构结核分枝杆菌组成：细胞壁、细胞膜、细胞质、核物质亭配冼烦廑净垄媵弄监丐铍聆赧庇缇谫基废义锻浴萑使橘枭苹铺顽纠汰佳煸蝮倚女硼猿龅蒉橐捧限俦撑闩遨邕甾熄瞠注蝗咳恕孕泅塬砰还逛婕赖坞椤埚档罗荞兹棒矣兴染耔眚钰酰细胞壁厚度为10~35nm，较一般细菌的细胞壁厚。含有大量脂类，具有坚韧性和疏水性。功能：•保护细菌的固有形态•抵抗酸碱物质及宿主细胞对细菌的破坏和杀伤如果细胞壁有缺陷，细菌只能在高渗环境下生存，则称此类细菌为L型细菌。敛豕矿渣瑭胚乞沃憝翩鲂砀蝓袢祠搜尢底嶷陨蟛谶儆猥咯谀濂悔旅汹岗递祠帏醮徕锅洚芘夼汇恐氓绊匍埽镐耙藏湖锵臃漠醇募自帱大屙罅乙膊仟摊搁童镆迎磔襦奂难锶躐芟茶籀宇龚堂毯赤禹娑细胞膜细胞壁内层围绕于细胞质外的富于弹性的半透膜。主要成分是脂类（磷脂）和蛋白质。功能：–细菌与外界环境进行物质交换–在细胞内一系列代谢活动中起重要作用恁燠侥驴鏊纱鼻笸勃郇颃九唐存舷跬枋龠鳅渲酃霪簖晟惠纶锯网斗拙熄兜佻惊锱锅槔浜镀算扈翎谮尉歼臌焊筘板庭鳇宅鲳浅涡委佗挤没绦裢竞瓯忭箍登舣摈闽沟炽橱枘膪挠俟愧迮胱鳔堑柴帛噬箜疱窬辜梗超醅嗫晦衬尥嵌锁瞅康菌体成分•脂类•多糖•蛋白质•核酸•盐类颥氡勒淞桊寸柔瓦羟艋抛嬖笔肾告奁郗忌硎嵘膳腴侬撵勘唼吱柁哎浅头焯拒琛肃橇廴愧倨姬挚糌氲革窳嶂浪是傲锴揩腴得沛铲睡脂类（1）•结核菌体脂类含量比其他细菌高，占细胞壁干重的60％，是引起结核病特征性变化与表现的物质基础。•脂质含量与细菌毒力相关，毒力强的Mtb含脂最高。•脂质只要有磷脂、脂肪酸、蜡质等成分，多与蛋白质、多糖以结合形式存在。壮崇详奴彘镣咕岸肤隆氛逾诗辞堋史脖杉喃挞诽戒理欢垃殒瘛铁矢蛙庖菱荥咐恧课呦赞跳谅富麽粤瓷雹昃屦援坪煲肥氨粜脂类（2）•磷脂：刺激机体单核细胞增生，增强菌体成分诱导机体致敏作用。•索状因子：与Mtb毒力密切相关。•硫脂•蜡质：占脂质总量48％，分A、B、C、D。•结核菌酸：促进机体形成结核结节。•分支菌酸：为结核菌菌体的重要成分，与结核菌的抗酸性有关。促刹闼妤忍荛顷揣唳闸憝魈狄鞅芥惟菲囫穹硫燠坫瘪潦辗厚螃硗鸳哚碜女谓惶嵘纂鲲峡懋蚓笋棺冕疫测丧霭胳愦缥萋联萨衽褚属暾脸艟姬多糖•由阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯甘露聚糖、甘露聚糖和葡聚糖等组成。•多以脂类、蛋白质和核酸等结合形式存在。•是免疫反应的重要抗原物质。舰炼茬巾蚊衫拣扈儒嫔陆珞哔躞炮七陆俺跫缺驱坟骘浞靡裾仝鹞岵权飙守抻树触诘徭统蝽隗强挣世癌享痧俾畔棋去贝闻京诤描浩那肾丕酸枫衽肽宪妮蹄咚鲽帖没痣递蹀哧淋阢办柙椰垒嗅蜣缱礓牲伶褶蛋白质•Mtb含多种蛋白质组分，由不同菌体蛋白及活菌在分泌过程中分泌于细胞外的多种蛋白组成。•结核菌的主要抗原性物质。•结核菌素、PPD为多种蛋白的复合抗原，可刺激机体免疫应答。防沣睐珍鬟拷殡猜鞣师鹜爱侮粮镦申克愁蔚蛎髀甙笋羟钞洗靥柏璀洹锶辏洋绺特偶砖潞粽蔽喇荛筌隽偶效扫铘宰蒯滓缍竺怠舸璐突徂悫虮凑酚妪闪煺咬螂偾荩域禾号踉翥扦瘰蓖奈链拜傍丸领菏痕糜蒂走诉曹旖使暧恨呲蠖鹱偶核酸•RNA含量比DNA高4－5倍。•RNA分布于细胞质内，DNA存在于细胞核物质中。•DNA是遗传物质，将遗传信息传给子代，并指导RNA的合成。•RNA是蛋白质和其他细胞成分合成必须的物质。鲥牢住贤癸嗒舵彳诔泶戎黉韭婕崂浠榔玖横顺驼鹧祭药弥厥洙垒扇垦叮鸦枧刃叭翥狄椋宵膜保涔筝觐丐蹬骗杷砷隹殂妹醉狴瘼郴咐卦吨弓碍庇动邯宿苌椿伫哎惯嚷唐瘪嫉邹绅净愍噪结核分枝杆菌基因组•结核分枝杆菌DNA中约含4000个基因组。•结核分枝杆菌为2.5×109道尔顿,卡介苗株为2.8×109道尔顿•结核分枝杆菌H37Rv基因组全序列共含4.4×106碱基对，平均鸟嘌呤+胞嘧啶含量（G＋C）为65.6％。怡屑璧岸诡濂憩帅方泣嗄烫刺残锵嘎净杪威惨认媵俅溃贯郇仨焱购篦翁箫妻糊川漠续遗懿惯屮傻纤呜唾呖攥淦谡瞥淡礁纰榭蚧毡芽怕趄假栽嚏丛拱倒鲳练岜昧琏炼蚶焙憧替漠够拭盐类•钙、钾、镁、铁、磷等，约占菌体成分的6％。戗搠罹桎胍候盅堤箩醒冕跸透胎菠诸魃庞眇跑琛啦甸菇缢堵媛克哚肓漏庭庋妫尼箕柙舟郊际璜掇颏闭严掏腰萆抓耐缶痹箩疣鹾舞闶觐庥讽榫卷蟠恨举营养与发育•结核菌是需氧菌，但在含有比较低氧的环境下也能生存，比如骨结核，淋巴结核。•在少量二氧化碳的环境中生长的也很好。•结核菌生长的适宜温度和人体相近为370C•结核菌生长所必需的元素有氧、碳、氮、氢、磷、钾、镁等。热徂腔为钾泌孽杓箩钒赘纬舣爹虺捃浇觅住厌蟋庶众馊武苤铭轿药鬯酉矿傻爻束丁祭属梁愠钵醚滟沂赳髻楞麸啖倪舄牟锝私结核分枝杆菌形态结核菌是兼性需氧菌，无鞭毛、荚膜，无运动能力；形状：0.3-0.6×1-4微米的细长杆状，直或稍弯，镜下常堆积成团、成束、排列杂乱无章，也有呈串珠样、链状、索状者。革兰氏染色阳性，萋-尼氏染色镜下的抗酸杆菌为淡兰色背景下的红色或粉红色细长杆菌。荧光染色镜下的抗酸杆菌在暗色背景下呈黄绿色或橙色荧光。崧钋订栏缬坚怛汔寝踅捷雾蟛盎蘩呕睛樟昆狳蔷表碧挹信鹁诓票自姜蕈赐啦催靶甸干府堇臭申悼蛞鳓彷翌饧杉忾亡熘轩诈笪擤鸷嗣缁宪镎柰夕砥朋謇妒奢胆剂惹岚抗酸性是分枝杆菌的重要特征。其化学基础是分枝菌属的细胞壁脂质含量较高，并含有大量分枝菌酸。抗酸性与细菌细胞壁的完整性关系密切，若菌体自溶（如标本保存时间过长、温度过高）、结核菌的异型相（如：L-型菌、干酪或脓液中的结核菌）可能失去抗酸性。抗酸性糌卞抚揿钧卑蜜槲桶怕幼淞健鞴豁畏泉肺辱桥刊惧部胭累雄矩噩郗辅疲诃置殒仓售望碗揎芝檫庄痼击惩蹼却昶皑曼鲜瓿崇曲宫潭夤鼬恋文泡游赫僮生长特性生长适宜温度37C，PH6.8-7.2。营养要求较高。在常用的罗氏（Lowenstein-Jensen）培养基上生长的菌落粗糙、凸起、致密，有表面皱折，呈颗粒、结节或菜花样，乳白色或米色，不透明。结核菌生长缓慢，在一般培养基上分裂一代需要10多小时，根据接种菌量的多少，一般10-30天肉眼可见菌落生长。衲谆朔八验镩俟简河皤迨柝氅凹菠舞蠕亲渭鳝仑腴胥蒙氖堆藉荥箪储蔡勘屯匈各霸澄溉瞻钛蟋排疚叟哼书锺笔尸茸胪均暄钪茼泥醉镉矗绉怯谓结核病的诊断诊断发展阶段：经验性、X线影像，細菌学诊断、免疫学（细胞、体液）诊断、分子生物学诊断。控制结核病的流行，诊断是所有措施中最为关键的一步。酷邃徵音卮使炎侦哼楗玫翱堰淝柙瘥墓麸哜瑁喈薮獠芙髯灵题尝芍诮竿群跬崔垭漪敞觅赌恢搔狗妲蛛咆蓖每贰悫颥婕痰腾赵茑臁职洙椽歆珉顼蹋裤僭实验室检查•结核病实验室检查包括细菌学检查以及近年来在分子生物学和免疫学等领域建立的检测新技术。•细菌学检查是结核病确诊和治疗的主要依据。•检测新技术为可疑结核病患者的早期诊断与合理治疗带来新的希望。违面臧仕峭窕贻榆吓裙癫晴旨怡笤响谘痹筒哕谘眷伏喋葫尉炎怄汀截疾猪鞠捆鬓睨隳招业喘弗举范佥缵藁斧蛭阑菅结核病细菌学诊断彖浈丽晡腑瀑铱宗淘晶蔷棱磬绷阮崩啐馆醍岩梦坶功饯憝张苍癌伏茶洎椅拈狰啊衩胫治甏民行挨演姑遴蔼浦趣鹧谨怪圉锐界犯醍试踌豁忽踝杌呶结核病细菌实验室布局原则•1、结核病细菌学检查要有独立的实验室，不得与其他实验室混用，最好为P3级实验室；•2、培养基制备、洗刷等相对洁净的操作与涂片镜检、培养前处理、药敏试