第28章 基因诊断与基因治疗(袁野)

目录基因诊断与基因治疗GeneDiagnosisandGeneTherapy第二十八章目录目录第一节基因诊断学基础第二节遗传病的基因诊断第三节传染病的基因诊断第四节肿瘤的基因诊断第五节基因诊断在法医学上的应用第六节基因治疗的概念及策略本章内容提要目录目录第一节基因诊断学基础BasisofGeneDiagnostics目录目录基因诊断之父—简悦威1976年加州大学华裔科学家KanYW用核酸分子杂交技术首次对一例α地中海贫血进行诊断。目录目录一、基因诊断的概念、特点及临床意义定义：利用分子生物学技术，通过检测基因及基因表达产物的存在状态，对人体疾病作出诊断的方法。基因诊断检测的目标分子是DNA、RNA，也可以是蛋白质或者多肽。目录目录诊断依据(遗传物质改变)DNA、RNA或蛋白质水平变化，如病毒基因及其转录产物在体内从无到有、癌基因表达水平从低到高；基因结构变化，如点突变引起基因失活、染色体转位引起基因异常激活或灭活。目录目录基因诊断的特点高特异性高灵敏性早期诊断性应用广泛性目录目录二、基因诊断中常用的分子生物学技术核酸分子杂交（Nucleicacidhybridization）聚合酶链式反应(PCR)单链构象多态性（SSCP）限制性片段长度多态性（RFLP）DNA序列测定（DNAsequencing）生物芯片（biochips）Western免疫印迹（Westernblotting）免疫组织化学诊断目录目录（一）核酸分子杂交Nucleicacidhybridization指两条单链核酸在一定条件（温度、盐离子和有机溶剂浓度）下，按碱基互补的原则重新配对形成双链的过程。目录目录核酸分子杂交流程待测核酸制备滤膜上核酸固化杂交去除未杂交的探针检测杂交信号核酸探针制备探针标记加入标记探针目录目录提取DNA→限制性内切酶消化DNA以产生特定长度的片段→凝胶电泳分离→变性处理→DNA转印到膜上并使其牢固结合→将标记的探针与膜上DNA片段杂交，分析杂交信号。1.Southern印迹杂交(Southernblotting)目录目录RNA经变性琼脂糖凝胶电泳后，转移到固相支持物上，通过分子杂交检测特定的mRNA分子的含量与大小。2.Northern印迹杂交(Northernblotting)目录目录3.斑点杂交（dotblotting）将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达产物的定性及定量的研究。目录目录4.反向斑点杂交（reversedotblotting）先将探针固定于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，将样品RNA或DNA标记变性后进行杂交。改变了传统杂交方法中一次杂交只能检测一种样品的局限，大大提高了基因诊断的效率。目录目录寡核苷酸中的碱基错配会大大影响杂交分子的稳定性，可用人工合成的针对正常和突变ASO探针进行反向斑点杂交，检测点突变，大大提高检测结果的可靠性。等位基因特异性寡核苷酸(allelespecificoligonucleotide,ASO）目录目录5.原位分子杂交荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization,FISH）挂锁FISH(FISHwithpadlock)目录目录荧光原位杂交（FISH）目录目录6.固相夹心杂交法(sandwichhybridization)待测靶基因序列上两个相邻但不重叠的DNA片段（A、B片段），分别作为捕捉探针（不标记的A片段）和检测探针（标记的B片段），同时与靶基因杂交。先将捕捉探针吸附于固相支持物上，与靶基因序列A部分杂交，再加入标记的检测探针，检测探针与靶基因序列B部分杂交，检测杂交信号。目录目录固相夹心杂交法示意图目录目录（二）聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR）模板引物dNTPMg2+TaqDNA聚合酶变性延伸退火目录目录PCR在基因诊断中的应用RT-PCR荧光定量PCR多重-PCRPCR-ASOAS-PCRPCR-SSCPPCR-RFLP目录目录1.RT-PCR目录目录2.荧光定量PCR荧光标记引物目录目录3.多重PCR多重PCR示意图A：普通PCR；B：多重PCR目录目录4.PCR-ASON：正常基因；H：杂合子基因；M：突变基因ASO1ASO2NHM目录目录（三）单链构象多态性分析（single-strandconformationpolymorphism,SSCP）DNA的突变造成DNA片段中碱基序列不同，变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的构象不同（单链构象多态性），利用迁移率的差别可使各种序列不同的单链分离开来。目录目录PCR-SSCP分析原理示意目录目录正常人纯合突变杂合突变+PCR-SSCP分析－目录目录（四）限制性片段长度多态性分析（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）由于DNA变异产生新的酶切位点或原有的酶切位点消失，在用限制性核酸内切酶消化时产生不同长度或不同数量的片段。可借助核酸分子杂交或PCR进行检测。目录目录设计适当的扩增引物，使扩增片段包括某一个或数个限制性内切酶识别序列，在PCR扩增后用该限制酶切割PCR产物，根据电泳后酶切片段长度变化，即可作出诊断。PCR-RFLP目录目录ABCDEFG－＋DEFBGCAGAATTCCTTAAGEFBG－＋C+DAEcoRⅠ限制性内切酶位点的变化目录目录（五）DNA序列测定（DNAsequencing）目录目录DNA序列测定原理(双脱氧末端终止法)目录目录左侧：正常；右侧突变序列分析用于基因诊断研究目录目录（六）生物芯片（biochips）基因芯片（genechips）蛋白质芯片(proteinchip)目录目录基因芯片杂交流程示意图目录目录基因诊断中常用的分子生物学方法比较方法优点与问题解决方案核酸分子杂交结果可靠但操作繁琐选择合适的探针PCR灵敏度、特异性高设计合适的引物SSCP操作简便、检出率不高选择合适的片段RFLP结果可靠但限制较多选择合适的限制酶DNA测序可自动化，但不适宜广泛使用与PCR配合使用生物芯片效率高，成本高，不适宜广泛使用选择合适的芯片目录目录三、基因诊断技术路线与方法直接诊断：直接分析致病基因分子结构及表达是否异常间接诊断：利用多态性遗传标志与致病基因进行连锁分析根据对致病基因或相关基因的了解程度决定基因诊断的技术途径选择。目录目录（一）直接诊断途径必要条件：◆被检测基因变化与疾病发生有直接因果关系◆被检基因正常分子结构已被确定◆被检基因致病的分子机制（突变位点或表达变化）已知目录目录5/——5/—3/3/—RFLP1.点突变的检测（1）有限制性内切酶位点改变目录目录斑点杂交、反向斑点杂交AS-PCR、PCR-SSCP、PCR-ASO、PCR产物直接测序5/——5/—3/3/—（2）无限制性酶切位点改变目录目录在DNA序列上有一段较长序列的重新排布。包括数十个碱基到数千个碱基的丢失、插入、替换、重复和倒位等，以及染色体突变或畸变，包括染色体的易位、缺失或染色三体（如唐氏综合征）等。2.基因重排的检测核酸分子探针杂交与PCR目录目录BamHIBamHIα2α1α210kb14kbprobe-珠蛋白生成障碍性贫血的直接基因诊断-珠蛋白基因不同程度的缺失可引起不同类型的-珠蛋白生成障碍性贫血目录目录根据引物3´端的互补与否，设计一对与正常或突变模板配对的特异引物等位基因特异PCRAS-PCR（allelespecificPCR）目录目录3.基因表达异常的检测mRNA的相对定量分析mRNA的绝对定量分析mRNA长度分析目录目录（二）间接诊断途径1.采用原因①致病基因未知或基因结构不确定②致病突变机制不清③致病位点不便检测目录目录DNA多态性：指群体中的DNA分子存在至少两种不同的类型，即个体间同一染色体的相同位置上核苷酸序列存在一定的差异或变异。多在进化中形成，本身并不致病，只是与某些遗传性致病基因有一定连锁关系。2.遗传标记目录目录间接诊断：检测与致病基因连锁的遗传标记三代遗传标记：①RFLP（基于核酸分子杂交技术）②VNTR(variablenumberoftandemrepeats);STR(shorttandemrepeats)③SNP(singlenucleotidepolymorphism)目录目录7.6kb13kb患者正常HBS的间接基因诊断——RFLP标记的连锁分析HapⅠ7.6kb13kbSouthern印迹杂交NHPN：正常；H：杂合子；P：患者（纯合子）；黄色区域为探针目录目录第二节遗传病的基因诊断GeneDiagnosisofHereditaryDiseases目录目录一、血红蛋白病（hemoglobinopathy）（一）镰状细胞贫血病（二）β-珠蛋白生成障碍性贫血症二、血友病（Hemophilia）甲型血友病基因诊断三、脆性X综合征目录目录（一）镰状细胞贫血病一、血红蛋白病1.镰状红细胞贫血患者基因诊断——ASO杂交法2.HBS的限制性内切酶谱分析3.HBS的PCR-RFLP分析目录目录正常的（N）的ASO探针：5´-ACTCCTGAGGAGAAGTCTGC-3´突变的（M）的ASO探针：5´-ACTCCTGTGGAGGAAGTCTGC-3´1.镰状红细胞贫血患者基因诊断ASO杂交法目录目录斑点杂交结果N：正常；M突变镰状红细胞贫血患者ASO杂交法检测N-ASOM-ASO正常突变突变纯合子杂合子纯合子5´3´正常基因1.15kb(CCTGAGG)×5´3´突变基因1.35kb(CCTGTGG)镰状红细胞贫病的限制性内切酶谱分析MstⅡ酶切位点（CCTNAGG）2.HBS的限制性内切酶谱分析目录0.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带者患者镰状红细胞贫血病的限制性内切酶谱分析目录目录目录3.HBS的PCR-RFLP分析正常人的扩增产物经MstⅡ消化可生成54bp和56bp两个片段，而镰状细胞贫血症患者的DNA片段不被酶切，仍为110bp，杂合子可见三条带正常人杂合体患者Marker目录目录1.PCR-RFLP分析-珠蛋白生成障碍性贫血症基因密码子17突变的检测M：pBR322DNA/MspI;1:未酶解片段；2：bA/bA；3：bA/bT；4：bT/bT注：由于54bp、114bp、72bp片段及分子量标准中低于200bp的片段太小，在0.8％的琼脂糖凝胶中不易被观察到（二）-珠蛋白生成障碍性贫血症目录目录-珠蛋白生成障碍性贫血症的反向斑点杂交分析2.反向斑点杂交目录目录二、血友病（Hemophilia）甲型血友病是由于血浆凝血因子VIII（FVIII）缺陷造成。甲型血友病的基因突变类型已有300余种，其中点突变占174种；另有部分患者是由于缺失或插入突变或内含子22的基因倒位所致。目录目录1.FVIII基因倒位的DNA印迹分析将基因组DNA用NcoI，DraI或BclI等内切酶（酶切位点位于交换点两侧）消化，用特异探针进行杂交分析，正常人表现为21.5kb、14kb和16kb三种类型。I型倒位患者表现为20、17.5和14kb三种类型；Ⅱ型倒位患者表现为20、16和15.5kb三种带型。在一些重型甲型血友病家系中还有其他异常带型出现。目录目录2.FVIII基因突变的检测（1）依赖于FVIII基因内或旁侧的多态性标记的连锁分析（2）RFLP连锁分析（3）VNTR分析（4）短串联重复序列（STR）的连锁分析目录目录三、脆性X综合征脆性X智力低下基因1（FMR1）5ˊ非翻译区遗传不稳定的(CGG)n三核苷酸重复序列的异常扩增以及相邻CpG岛的异常甲基化。正常人中约为8～50拷贝。男性和女性携带者增多到52～200拷贝，相邻的CpG岛未被甲基化，称为前突变（premutation）。男性患者和脆性部位高表达的女性中，达到200～1000拷贝，相邻的CpG岛也被甲基化，称为全突变（fullmutation）。全突变