第十三章分子诊断

第十二章分子诊断一、分子诊断的概念和特点概念：利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，通过检测基因结构或其表达水平是否正常，从而对人体健康状态和疾病作出诊断的方法。传统的诊断：表现型→基因型基因诊断：基因型→表现型（逆向诊断）特点特异性强灵敏度高早期诊断性适应性强一、分子诊断的概念和特点检测致病基因突变；分析与疾病连锁的遗传标志；建立多基因疾病表型克隆；定量分析致病基因的表达水平已明确疾病表型与基因型的关系分子诊断的前提4二、分子诊断策略直接诊断——直接检测致病基因的突变基因突变类型—缺失、点突变、重复、插入等间接诊断——应用DNA多态性为遗传标记进行连锁分析，确定待测者是否得到带有致病的染色体，从而间接地作出诊断DNA多态——RFLP、VNTR、SNPDNA多态（DNAPolymorphism）群体中每个个体DNA区域中等位基因（或片段）存在两种或两种以上的形式，对基因功能没有影响，称DNA多态。DNA分析中常用的遗传性多态性标记有3类：1）RFLP：称限制性片段长度多态性，为第一代多态性标记；2）重复序列多态性（VNTR）：如STR其重复次数在人群中存在变异，形成多态即VNTR，为第二代多态性标记；3）单碱基多态性（SNP）：发生在基因组中的单个核苷酸的替代，为第三代多态性标记。二、分子诊断策略三、分子诊断常用技术核酸分子杂交技术等位基因特异寡核苷酸探针(allelespecificoligonucleotide,ASO)DNA限制性长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RLFP)分析PCR-SSCPDNA测序DNA芯片技术点突变（CtoT）5’3’3’5’G5’3’引物1引物2探针1探针2A等位基因特异寡核苷酸探针（ASO）原理指DNA序列上发生一个变异后获得或丢失了一限制性识别位点，使DNA限制性片段长度发生变化，在人群中形成两种或两种以上的限制性类型利用特定限制性识别位点进行基因分析限制性片段长度多态性分析（RFLP）RLFP分析法RFLP分析优点•分辩率高，无需标记,重复性好，简便快速直观•主要用于核酸变异分析比较,微生物的分群分型，癌基因分析，遗传病的诊断等。局限只能应用突变引起限制性酶切位点改变筛选，检测效率低。原理将经扩增的DNA片段变性形成单链，由于序列不同，单链构象就有差异，在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳的迁移率不同，通过与标准物的对比，即可检测出有无变异。优点•检测基因变异，具有操作简便、快速特点，不需特殊设备，适用于大样本筛选。•己广泛应用于检测各种病原体基因的点突变及缺失突变，基因的多态性分析等。PCR/单链构象多态性分析（SSCP）（PCR-SSCP）示意图DNA测序DNA自动测序结果举例DNA芯片技术四、分子诊断的应用及举例遗传疾病肿瘤感染性疾病判断个体疾病易感性器官移植组织配型法医学中个体识别、亲子鉴定×MstⅡ酶切位点(CCTNAGG)5´3´正常基因5´3´突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析GAG→GTG↓谷Aa→缬Aa+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带着患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析NormalβΑGeneProbe——与正常ProbeβΑ杂交稳定MutationβSGeneProbe——与异常βS杂交稳定镰状红细胞贫血患者基因组的ASO探针杂交20斑点杂交结果：镰状红细胞贫血患者基因组的ASO探针杂交βΑ/βΑβΑ/βSβS/βS正常探针异常探针正常人纯合突变杂合突变Leber病患者PCR/SSCP分析+﹣