第十一章 动物实验技术

第十一章动物实验技术第一节实验动物的固定、标记第二节实验动物的给药途径和采血方法第三节实验动物用药量的确定及计算方法第四节实验动物的麻醉和处死方法第五节动物实验基本设计常用药物的最大给药量动物项目灌胃皮下注射肌肉注射腹腔注射静脉注射大鼠最大给药量2mLlmL0.4mL2mL4mL使用针头16号(钝头)6号6号6号5号小鼠最大给药量lmL0.4mL0.4mLlmL0.8mL使用针头9号(钝头)5l/2号51/2号51/2号4号豚鼠最大给药量3mLLmL0.5mL4mL5mL使用针头16号(钝头)61/2号61/2号7号5号家兔最大给药量20mL2mL2mL5mL10mL使用针头10号导尿管61/2号61/2号7号6号人与实验动物之间药物剂量的换算人与实验动物对同一药物的耐受性，动物比人大，即单位体重的用药量比人要大。1.一般可按下列比例换算，每单位体重人的药量为1，则小鼠、大鼠为25-50，兔、豚鼠为15-20，狗、猫为5-10。2.在新药药效研究中多以下列公式转换人及不同动物之间的药量：人及不同实验动物之间药物量对应值例如：某药物在60kg体重的病人的剂量为21.0g.kg-1.d-1，一只5kg的猴为53.6g.kg-1.d-1，一只10kg重的犬为40.4g.kg-1.d-1，一只20g的小鼠则为260.6g.kg-1.d-1。实验动物的血样采取一、小、大鼠剪尾采血1)此法每鼠可采10次以上。2)小鼠每次0.1ml。3)大鼠每次0.4ml。2.眼眶后静脉丛采血1)小鼠每次0.2-0.3ml。2)大鼠每次0.5ml。3.股动脉采血1)小鼠每次0.5ml。2)大鼠每次2.0ml。二、豚鼠1.耳缘切口采血：0.5ml。2.心脏采血：3.足背正中静脉采血：三、家兔1.耳缘静脉采血：5-10ml。2.耳中动脉采血：15ml。3.心脏采血：20-25ml。四、犬1.前肢皮下头静脉和后肢外侧小隐静脉采血：10-20ml。2.颈静脉采血：3.心脏采血：常用实验动物的最大安全采血量与最小致死采血量动物种类最大安全采血量(mL)最小致死采血量(mL)小鼠0.10.3大鼠12豚鼠510家兔1040狗50300猴1560常用麻醉剂的用法及剂量麻醉剂动物种类给药途径剂量(mg/kg)常用浓度(％)戊巴比妥钠犬、兔静脉303腹腔40～503大鼠、小鼠、豚鼠腹腔40～502硫喷妥钠犬、兔静脉15-202大鼠腹腔401小鼠腹腔15-201氯胺酮犬、猫腹腔10-4010大鼠、小鼠腹腔100～20010氯醛糖兔静脉80-1002大鼠腹腔502乌拉坦兔静脉750-100030大鼠、小鼠皮下或肌肉800-100020第五节动物实验基本设计一、设计原则1.对照（antitheses）性原则：是要求在实验中设立可与实验组比较，用于消除各种无关因素影响的对照组。空白对照：不施加任何处理因素实验条件对照：不用处理因素，但施加某种与处理因素相同的实验条件。标准对照：用现有标准方法对照，如已知有效药物、公认标准疗法。2．随机（random）化原则动物实验一般采用完全随机分配或分层随机分配。小动物实验一般先配对或配伍，然后“对”内或“伍”内进行随机分配大动物多半先分层，然后在层内随机分配。3．重复（repetition）的原则指同一处理要设置多个样本例数降低试验误差。应该在保证实验结果具有一定可靠性的条件下，确定最低的样本例数1)一般估测的样本数小动物(大鼠、小鼠、蛙、鱼)：每组10-30例,计量资料每组不少于10例,计数资料每组不少于30例；中等动物(豚鼠、家兔)每组8-20例,计量资料每组不少于8例,计数资料每组不少于20例；大动物(犬、猫、猪、羊等)每组6-20例,计量资料每组不少于6例,计数资料每组不少于20例.2)按统计学方法测算的样本数n=2б2(tα+tβ)2/δ2n为样本含量，б为标准差；tα取有显著性的t分布值，t0.05=1.96；tβ为无显著性的t分布值，1-β为实验检验能力，动物实验一般取1-β=0.80，t0.20=0.842；δ为处理组与对照组均值间的差异，可从预实验或文献资料库中获得。举例：给某种动物饲喂一种药物，预实验中每月体重增长比对照增加30±15g（均值±标准差）。设显著水平为95%，检验能力为80%，则正式实验所需样本含量n为：n=2152（1.96+0.842）2/302=3.93即每组只需4只动物。二、基本设计方法1.单组比较设计指在同一个体上观察实验处理前后某种观测指标的变化。优点：能排除个体间生物差异。缺点：不适用于在同一个体上多次进行实验和观察的情况。2.配对比较设计指实验前将动物按性别、体重或其它有关因素加以配对，以基本相同的两个动物为一对，配成若干对，然后将一对动物随机分配到两组中。优点：减少两组实验误差及动物间的个体差异。缺点：应考虑种属、品系、性别、年龄与体重、同父母、同胎次出生等因素对实验结果的影响。举例：为研究VitE缺乏饲料对大鼠肝脏中VitA含量(u/mg)的影响，选取同性别(雌、雄各半)、同月龄(断乳1个月)、同体重(50g+2g)等正常大鼠配成10对，对每对中每只大鼠按随机数字表(或抽签)随机分配到给以正常饲料组和VitE缺乏饲料组，分饲条件相同的不同笼中，经1个月饲食后杀掉，按每对分别取肝脏，测得VitA含量(u/mg)如表。大白鼠对别正常饲料组VitE缺乏组13.952.6523.803.3533.452.4543.352.6553.702.6563.903.1573.802.9083.051.9093.651.70102.002.503.完全随机化设计将动物随机分配到处理组及对照组做实验观察。优点：统计分析也比较简单，抗数据缺失能力较强。缺点：对非实验因素缺乏有效控制，适用于实验对象同质性较好的实验设计。举例：为比较小白鼠接种3种不同菌型伤寒杆菌(9D、11C、DSC1)后存活日数的差异，选择同品系、性别(雌、雄各半)、体重(土1s)、月龄(土2天)、生理精神状态、饲养条件等小鼠30只，依随机数字表随机分为3组，在相同条件下接种菌苗，后观察存活日数如下表。9D11CDSC1257461138625671097752121156646347104.随机区组设计在动物实验时，可将一窝小鼠或大鼠划为一个区组，确定数个区组后，按区组随机化原则将各区组的动物随机分配到处理组和对照组。优点：均衡性好，可减少误差，提高实验效率，统计分析也较简易。缺点：抗数据缺失能力较低。若一个区组的某个动物发生意外，那么整个区组都得放弃，或不得已采取缺项估计。举例：有人用4种不同种系的未成年大鼠做实验，每一种以同窝雌大白鼠3只，随机分配注射3种不同剂量的雌性激素(mg/100g)后，在相同条件下称其子宫重量(g)，见表：大鼠种系0.20.40.8116116145242681153701111334423584805.析因设计可以分析多种交互作用，但一般采用较简单的析因试验。当水平和因素过多，不但计算复杂而且解释困难。举例：观察绝经促性腺激素(HMG)、绒促激素(HCG)及其交互作用，随机将20只幼雌大白鼠分成4组。第一组空白，第二组每天注射HMGl个单位，第三组每天注射HCG20单位，第四组每天HMGl单位、HCG20单位，一定时间后取卵巢称重，以每10g大白鼠体重卵巢mg数表示(mg/10g)，结果如表：1234空白HMGHCGHMG+HCG912143912111729111416411315134610131940∑556579195三、实验结果变异分析1.实验间变异处理会使对照组和实验组平均度量值发生变化，即实验间变异。降低实验间效应变异将减少对同一实验的重复性。实验结果必须是建立在可重复实验的基础上。2.实验内变异包括：实施实验过程造成的变异、分析变异、个体内变异和固有的个体间变异。通过明显的减少实验结果中个体间变异来减少实验动物数量是可行的。3.动物实验间和实验内变异的来源动物实验中变异的一个重要来源是实验动物自身。来源于动物的年龄、体重、同窝动物的数量及其它可能在实验前就已经存在的差异。基因型和环境之间的相互作用对实验间和实验内变异以及处理有不同的影响。