边缘无浆体病分子诊断ELISA和温氏附红细胞体PCR检测方法

华中农业大学硕士学位论文边缘无浆体病分子诊断ELISA和温氏附红细胞体PCR检测方法的建立姓名：杜凯申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：赵俊龙;李树清20070601边缘无浆体病分子诊断ELISA和温氏附红细胞体PCR检测方法的建立作者：杜凯学位授予单位：华中农业大学相似文献(10条)1.学位论文王健温氏附红细胞体对牛血液生化指标的影响及双抗体夹心ELISA、PCR诊断方法的建立2006采集自然感染温氏附红细胞体的牛血，用柠檬酸钠抗凝，制成血压片和姬姆萨染色的血涂片，光学显微镜下观察红细胞及附红细胞体的形态。附红细胞体单个或聚合在一起存在于血浆中，附有附红细胞体的红细胞发生变形，姬姆萨染色后附红细胞体被染成淡紫色。对采集的血液按其镜检感染率进行分组，分别测定其一氧化氮(NO)含量、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活力。结果显示，随着附红细胞体感染强度的增加，血浆中相应的NO和MDA含量逐渐升高，SOD活力逐渐降低。表明这三种生化指标的变化与附红细胞体的感染有关。无菌采集自然感染附红细胞体的抗凝血，通过PBS-T缓冲液洗涤、高速低温离心和超声波裂解等方法获得纯化的温氏附红细胞体抗原。将该抗原按常规方法免疫家兔，制备了兔抗温氏附红细胞体的高免血清。运用辛酸硫酸铵法提取血清中的免疫球蛋白IgG，聚丙烯酰胺(PAGE)垂直板电泳结果显示所提取的IgG纯度较高，并且此法操作简便，表明其是一种实用高效的抗体提纯方法。将提取的免疫球蛋白IgG，用过碘酸钠改良法制备酶标抗体，建立了从血液中检测奶牛温氏附红细胞体抗原的双抗体夹心ELISA。试验最佳条件为，抗体最适包被量为156μg/mL，酶标抗体最适工作浓度为1：400稀释，抗原及酶标抗体的作用时间分别为37℃1h，封闭液为5﹪犊牛血清，底物显色时间为15min.对温氏附红细胞体抗原的最低检出量为6.64μg/mL.全血及带有附红细胞体的红细胞与纯化抗体反应的最大稀释倍数分别为1：160和1：40，可按照此浓度检测血液中的附红细胞体抗原。对该方法进行特异性阻断试验、交叉性试验和重复性试验，结果表明它是一种特异、灵敏、快速的诊断方法，并适合作群体检测。从河北省不同地区采集奶牛血样222份，应用建立的双抗体夹心ELISA检测方法对其进行检测，结果阳性检出率为91.0﹪，说明本省奶牛群中温氏附红细胞体感染普遍。本次调查揭示了河北省牛群尤其是规模化牛场中温氏附红细胞体的感染情况，从而为牛附红细胞体病的综合防制提供可靠依据。本试验根据温氏附红细胞体的16SrRNA基因参考序列的保守区，利用软件Primer5.0设计合成了一对特异性引物，对温氏附红细胞体的基因组DNA进行了PCR检测，扩增出一段985bp的DNA序列，EcoRⅠ酶切鉴定得到两条500bp左右的条带，与预期结果一致，说明该方法扩增出了温氏附红细胞体的特异性条带。通过敏感性、特异性、重复性和扩大性试验证明，该方法具有特异、灵敏、快速的优点，可用于牛附红细胞体病诊断和流行情况监测。2.会议论文李树清.杜凯.赵俊龙.胡永强.王巧全.姚宝安温氏附红细胞体病PCR诊断方法的建立及应用2006本文根据温氏附红细胞体16SrRNA基因序列(Genbank登陆号为AY946266),设计一对种特异性引物,建立了温氏附红细胞体的PCR诊断方法.特异性试验和敏感性试验表明,此诊断方法与猪附红细胞体、东方巴贝斯虫、牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、边缘边虫、弓形虫无交叉反应,能检测温氏附红细胞体最低DNA量为1.78fg.用此PCR方法检测湖北某实验动物场黄牛阳性率为53.8％、湖北某奶牛场奶牛阳性率为11.4％、苏州某奶牛场奶牛阳性率为9％、进口新西兰奶牛血样60份全为阴性.3.学位论文张富梅温氏附红细胞体抗原特性及16SrRNA基因系统进化分析研究2006牛附红细胞体病是由温氏附红细胞体(E.wenyoni)引起的一种传染病。长期以来，由于该病多呈隐性感染，发病率较低，未引起人们的足够重视。近年来研究发现，该病的发病率呈上升趋势，成为影响养牛业发展的主要疾病之一。同时，国内外对温氏附红细胞体的研究相对较少，有关形态学特性、分类地位、诊断准确性、有效预防等问题都亟待进一步研究。本试验采用自然感染E.wenyoni的牛血为试验材料，对E.wenyoni的抗原特性及其16SrRNA基因特点进行了研究：首先，研究了E.wenyoni的形态学特点、运动性及其对牛血液学指标及免疫指标的影响，旨在探索E.wenyoni的致病机理，并为确诊牛附红细胞体病提供理论与实践依据；其次，从自然感染牛血液中纯化附红细胞体，应用SDS-PAGE和免疫印迹试验对E.wenyoni抗原蛋白组分进行了初步分析，为制备特异性诊断抗原、提高血清学诊断的特异性和准确性以及研制高效附红细胞体疫苗奠定基础；最后，对E.wenyoni16SrRNA基因进行了扩增，对扩增产物进行克隆和测序，构建系统发育树并进行分析，目的在于从系统进化角度探讨E.wenyoni的分类学地位。显微镜观察发现，被感染的红细胞变形，E.wenyoni呈多形性，具有折光性，游离于血浆中的E.wenyoni具有运动性，附着于红细胞上后，似乎停止运动，但实际上能使红细胞发生震颤；血液学指标测定结果表明：随着感染强度的增加，牛血液中红细胞数(RBC)、血红蛋白含量(HGB)和红细胞比容(HCT)均降低，而白细胞数(WBC)、红细胞渗透脆性和红细胞沉降率(ESR)却增加；免疫指标测定结果显示：高强度感染牛的红细胞C3b受体花环(C3bRR)率、红细胞免疫复合物花环(ICR)率以及血液中ANAE+T淋巴细胞百分率均降低，这表明牛严重感染后，红细胞免疫及细胞免疫处于低下状态。SDS-PAGE结果显示，E.wenyoni全蛋白分子量范围为24kD～150kD，主要的9种蛋白质分子量分别为141.34kD，107.27kD，86.03kD，68.05kD，56.21kD，44.30kD，32.99kD，28.89kD，24.59kD。应用免疫印迹试验筛选出了3种特异性蛋白质，分子量分别为147.31kD，49.03kD，35.72kD。克隆了E.wenyoni16SrRNA部分基因，测序结果显示：所测序列与GenBank发表的E.wenyoni16SrRNA基因序列(AF016546)相似性最高，达97.9﹪。系统发育分析表明，所测序列与支原体属病原代表种的序列接近，同源性约为70﹪，而与无浆体科病原代表种的序列相差较远，同源性约为50﹪。可见，E.wenyoni应归为支原体属，而不属于立克次氏体目、无浆体科。4.期刊论文李树清.杜凯.胡永强.陈声国.陈志飞.周艳琴.赵俊龙.LIShu-qing.DUKai.HUYong-qiang.CHENSheng-guo.CHENZhi-fei.ZHOUYan-qin.ZHAOJun-long温氏附红细胞体病PCR诊断方法的建立及其应用-华中农业大学学报2007,26(6)为建立特异、敏感、快速的温氏附红细胞体诊断方法,根据温氏附红细胞体16SrRNA基因序列(GenBank登录号为AY946266),设计1对种特异性引物,建立了温氏附红细胞体的PCR诊断方法.特异性试验和敏感性试验结果表明,该方法能特异性地扩增温氏附红细胞体16SrRNA基因序列的特异性片段,检测温氏附红细胞体最低DNA量为0.178fg.利用该方法对湖北省、江苏省和黑龙江省温氏附红细胞体病感染情况进行了流行病学调查,结果显示阳性感染率分别为10.3%、5.3%、45.8%,说明温氏附红细胞体在湖北省、江苏省和黑龙江省均存在,流行病学调查显示湖北省感染率较高、流行较广.5.学位论文付媛猪附红细胞体病PCR诊断方法的建立和去脾猪附红细胞体病的研究2005附红细胞体病是由附红细胞体(Eperythrozoon)寄生于多种动物的红细胞表面、血浆及骨髓中引起的一种人畜共患病。关于附红细胞体的分类地位目前仍有争议，传统的分类学方法将附红细胞体列为立克次氏体，但是近年来16SrRNA基因的系统发育分析的结果表明，附红细胞体更接近于支原体(Mycoplasma)。猪的附红细胞体病主要引起仔猪发热、贫血苍白、黄疸和母猪流产等症状，常与其他猪病混合感染危害严重，防治十分困难，给养猪业造成巨大经济损失。直接镜检是目前临床上诊断该病的主要手段，包括鲜血压片和涂片染色，但该方法假阳性较多见。动物实验是确诊的手段之一，但所费时间太久。血清学诊断方法包括间接血凝试验(IHA)、补体结合试验(CFT)和酶联免疫吸附试验(ELISA)等，但由于附红细胞体抗体水平的变化没有规律而常出现假阴性的结果。鉴于上述原因，为了建立特异准确的诊断方法，本研究开展了附红细胞体病的聚合酶链式反应(PCR)诊断方法的研究。根据已报道的附红细胞体基因组的序列(序列号AJ504999)设计了一对引物，建立了特异性的聚合酶链式反应，扩增片段大小为782bp，然后将扩增产物测序，测序结果与GenBank上猪附红细胞体序列进行同源性比较，同源性达到99％。特异性试验表明只有猪附红细胞体模板可以扩增出特异性条带，而健康猪血液、弓形虫、猪伪狂犬病毒、多杀性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌样品没有该条带。利用建立的PCR方法对湖北、河南省的15个猪场进行了PCR检测，结果有8个猪场为阳性，阳性率最高的达到83.3％，平均阳性率为26.4％。在此基础上又设计了一条引物，建立了半巢式PCR，敏感性试验结果表明最低检测出0.061fg的质粒DNA浓度。本研究建立的猪附红细胞体病PCR诊断方法为附红细胞体的体外培养、病原学研究及该病的诊断和致病机理的研究等奠定了基础。本研究还对摘除脾脏的猪感染猪附红体，进行了试验性猪附红细胞体病的研究。感染猪出现了皮肤发红、出现紫斑、眼睑肿胀、体温升高等症状。试验猪感染E.suis后红细胞数量、血红蛋白数没有明显变化，表明贫血不明显；葡萄糖有显著降低：血清谷草转氨酶和谷丙转氨酶都有升高的趋势：半巢式PCR方法从接种后第1d起即可监测到，持续到试验结束。但利用姬姆萨涂片染色监测染虫率没有明显上升。另外，本研究从自然感染附红细胞体的湖北黄牛无菌采集血液，分离附红细胞体并提取病原基因组，用血营养菌的16SrRNA基因的通用引物进行PCR扩增，得到长约1.5Kb的扩增片段，将其克隆到pMD18-T载体后进行测序和分析。结果表明该片段全长为1471bp(GenBank收录号为AY946266)，同源性分析表明该序列与Neimark(1997)公布的温氏附红细胞体的16SrRNA基因序列同源性达到98.7％，证实该病原为温氏附红细胞体。将该序列与5种支原体、14种血营养菌及边缘边虫的16SrRNA等进行比较，建立系统发育树，结果表明我国的温氏附红细胞体同边缘边虫的关系较远，而与肺炎支原体组的亲缘关系较近。6.期刊论文高光平.毕可东.陈萍.邹明.GAOGuang-ping.BIKe-dong.CHENPing.ZOUMing8种药物对温氏附红细胞体的体外杀灭效果-河北科技师范学院学报2009,23(1)为确定药物对温氏附红细胞体病的体外杀灭效果,在70mLRPMI-1640培养液中添加30mL新生牛血清,2.0g葡萄糖,0.20gNaHCO3,37℃,体积分数为0.05的CO2条件下,进行了咪唑苯脲、磷酸伯氨喹、盐酸多西环素、敌百虫、延胡索酸泰妙菌素、依沙吖啶、三氮眯、大蒜素注射液等8种药物对温氏附红细胞体的体外药物杀灭试验.结果表明,咪唑苯脲、磷酸伯氨喹的杀灭效果最好,且在有效浓度范围内对红细胞的影响较轻微;敌百虫、依沙吖啶的杀灭效果也很好,但是对红细胞的损伤较咪唑苯脲和磷酸伯氨喹重.因此,治疗温氏附红细胞体病应首选咪唑苯脲或磷酸伯氨喹,其次为敌百虫和依沙吖啶.7.学位论文高光平温氏附红细胞体体外培养、药物筛选及疾病治疗的试验研究2007在RPMI-1640、DMEM、M199、HL四种培养基中分别添加不同比例的新生牛血清、葡萄糖和NaHCO,3进行牛温氏附红细