(简)发酵过程参数相关分析(庄英萍)

发酵过程参数相关分析原理及应用国家生化工程技术研究中心（上海）庄英萍[e-mail]主要内容发酵过程特性概述发酵过程的参数分类及检测理化相关生物相关应用举例下阶段工作展望发酵过程特性概述生物反应器中基因、细胞和反应器不同尺度网络之间存在着以时间为坐标多输入多输出的互动关系。表现在同一尺度下多过程的耦合，不同尺度下也往往会有不同过程发生。多尺度的研究方法要求从一个尺度观察另一尺度现象，即所谓跨尺度观察与控制，即可能提供在生物技术研究中所没有发现的现象。研究尺度间相互作用和耦合的原则和条件，只有这样才能进一步分析不同尺度下的各种子过程之间的相互量化关系，并与已知条件关联，构成描述复杂系统的综合模型或描述。发酵过程的特性发酵过程多以分批操作形式进行，随着细胞生长和代谢过程的变化，各种测量参数（自动或手工实验室测定）随时间的变化而变化，通过对这些变化进行研究，有可能获得对发酵工艺和过程控制的有关认识，有利于发酵过程优化。有必要在计算机辅助下对过程进行时序性综合研究和分析。通过这些趋势曲线可以看出检测参数的多样性、时变性、相关耦合性和不确定性。代谢曲线对照常规发酵过程分析的缺陷性分析发酵数据时，通过产品小试研究形成工厂生产的工艺控制为目标，把重点放在寻找最佳的操作点或某参数时序变化规律，在方法上主要依据人工经验的试差法，由此逐渐形成作为生产工艺管理的工艺规程。----缺乏机理性认识，有局限性。发酵过程动力学研究强调了参数趋势曲线的动态性并采用了过程数学模拟等进行仿真，可进一步总结经验规律，引入动态优化控制方法，为过程工艺优化研究提供了内容。----强调参数各自的时序变化，缺乏数据时序变化之间的相关分析发酵过程特性产生的原因随着菌体生长和基质消耗，过程状态随时间变化的，因此测量参数的时变性反映了发酵过程的时变系统特征。由于发酵过程多容量性和严重非线性特征，表现在过程测量参数的离散性，主要是细胞代谢对环境因子的高度敏感性和细胞代谢的不可逆性，有时还表现在基因水平的启动和表达的影响，输入的初始条件极细微的差别会产生结果的巨大变化，即发酵过程混沌现象。由于对上述现象缺乏认识，更无法控制，也就描述为测量参数的不确定性，应加强有关生物学机理的认识，才能在产品的工业发酵生产上取得突破性进展。好氧生物反应器供氧情况变化引起的变化当降低搅拌转速时，供氧速率（OTR）下降必然引起溶解氧浓度（DO）的下降，这是一个属于生物反应器系统中的过程传递和混和问题OURCCaKCL)*(dtd如果DO下降到临界氧浓度以下时，就引起菌体呼吸强度的减弱，这实质上是氧成为限制性基质时的动力学行为CKCXQOUROmO当DO继续下降，就可能产生厌氧代谢，代谢途径发生迁移，甚至发生胞内酶体系的改变───发生反应体系的结构性变化。温度诱导的基因工程菌生长与表达当用λPL,C启动子构建表达载体时，PL,R启动子受λ噬菌体cI基因的负调控，cI基因产生的阻遏蛋白结合在操纵基因上，阻止转录的进行。当在28～30℃培养时，利用cI的温度敏感突变基因的突变体可以产生有活性阻遏蛋白，阻遏PL,R转录，细菌大量生长。温度上升到42℃，造成阻遏蛋白失活，PL,R解除阻遏，启动外源基因的高效转录和表达，从而合成大量有价值的外源蛋白。参数曲线相关分析的优势从发酵过程多尺度系统理论来看，参数趋势曲线相关有可能是某一尺度的线性或动力学行为，也可能是多尺度系统的结构性突变，因此用常规的单一尺度模式有时就无法解释过程中发生的许多现象。虽然这些过程检测大多是环境中的状态或操作量，但可以通过进一步分析，得到反映分子、细胞和反应器工程水平的不同尺度问题的联系，从而实现跨尺度观察和跨尺度操作。参数相关耦合的定义参数耦合相关是指各种直接参数、间接参数以及实验室手工参数随着发酵过程的进行而变化，并且参数间发生某种耦合相关。这种参数相关是生物反应器中物料、能量或信息传递、转换、以及平衡或不平衡的结果，其微观因素也许只是发生在基因、细胞或反应器工程水平的某一个尺度上，但最终会在宏观过程中有所反映，这就为我们研究生物反应器中不同尺度的数据关联分析方法提供了线索。发酵过程参数检测技术要求越来越高微生物学生物化学分子生物学发酵工艺学化学工程现代控制理论各种工程开发参数检测(自动或手工检测)综合性研究：定性和定量的描述工业生产——随着生物技术的快速发展，生化工程对传感技术、计算机数据处理的要求越来越高，有望形成新的技术领域在线计算机（一）、发酵过程的参数分类及检测直接参数通过传感器把非电量变化直接转化为电量变化，实时地送计算机数据采集。物理参数、化学参数、生物量参数就地测量(inline)、在线测量（online）手工参数:取样后实验室手工测量参数，离线输入。间接参数:由一些直接参数计算得到的各种反映过程特性的参数。反映菌体代谢活性、反应器工程特性、反应器操作特性等。直接参数物理参数化学参数温度压力功率输入通气流量泡沫水平加料速率基质前体诱导物培养液重量培养液体积生物热培养液表观粘度积累消耗量基质酸碱消泡剂细胞量气泡含量气泡表面积表面张力pH氧化还原电位溶解氧浓度溶解CO2浓度排气O2分压排气CO2分压其他排气成分成分浓度糖氮前体诱导物产物中间代谢物金属离子脱氢酶活力各种酶活力细胞内成分蛋白质DNARNA生化反应过程中参数检测的复杂性1)反应器上插入的传感器必须能耐热，经受高温灭菌；2)菌体以及其他固体物质极易吸附在传感器的表面，使一些传感器的使用性能受到影响；3)生物反应过程往往是耗氧的过程，故在反应器内通气带来的气泡影响，往往对测量过程会造成干扰；4）使用在反应器上的传感器，其结构必须防止杂菌进入和避免产生灭菌死角，因而使传感器结构复杂或使其检测性能产生变化；5)生化反应过程中化学成分的分析往往是重要的检测内容，但对其电信号的转换困难。带有计算机系统的的生物反应器检测参数示意图间接参数摄氧率（OUR）二氧化碳生成率（CER）呼吸商（RQ）细胞浓度（X）细胞生长速率（Rx）比生长速率（μ）细胞得率（YX/S）糖利用率氧利用率比基质消耗率（u）前体利用率产物量（P）比生产率（υ）体积氧传递系数（KLa）功率、功率准数雷诺数细胞量生物热碳平衡能量平衡几个重要的间接参数计算公式（二）、参数相关基本特性各种直接参数、间接参数以及手工测定的实验室参数随着发酵过程的进行而变化，并且参数间发生某种耦合相关，这种参数相关反映了发酵过程多尺度（水平）的问题特征。发酵过程检测参数的特性所检测到的参数均是动态平衡的结果检测参数=供给—消耗残留基质浓度对代谢的影响限制性基质的概念代谢曲线一发酵过程典型的代谢曲线发酵过程参数相关分类理化相关纯属物质理化性质变化所引起的参数相关生物相关生物相关是指通过生物细胞的生命活动所引起的参数之间耦合相关（三）、理化相关纯属物质理化性质变化所引起的参数相关物理过程：物质或能量传递、混和、平衡或不平衡*传热（加热或冷却）∽温度发酵过程中打开冷却水的阀门引起罐温的下降化学过程：发生某些化学反应的结果*酸碱加入∽ｐＨ，加入某种酸碱物质引起的pH的变化理化相关*搅拌转速、通气流量、罐压力∽溶解氧DO转速↑，气泡↑，气液接触表面积↑，KLa↑，OTR〉OUR，DO↑理化相关*通气流量∽排气二氧化碳（ECO2)*通气流量∽溶解二氧化碳（PＣＯ２）∽ｐＨ罐压测量与DO值常规测量与代谢流方法测量的差异*加油泡沫∽ＣＥＲ，气泡破裂释放ＣＯ2理化相关（二）理化相关*搅拌转速∽ｐＨCO2释放后pH变化*温度↓∽DO传感原理：T↓,OUR↓,DO↑理化相关的普遍特性*理化相关对不同细胞对象具有普遍性，不因细胞生理活性的变化呈现不同的特性。要注意过程数据采集的非同步性引起的误相关，特别要注意间接参数的变化产生的对过程研究的误导。（四）、生物相关生物相关是指通过生物细胞的生命活动所引起的参数之间耦合相关，主要体现在二种方式：其一，通过生物细胞生长代谢后引起的培养液物性的变化，进而引起的参数相关。菌体生长引起的生物相关特性*快速生长期时，培养液粘度上升，KLa下降，引起DO水平的变化。*培养液粘度的变化也会引起溶解二氧化碳CO2与排气二氧化碳浓度ECO2的差异。*轴向流桨叶所持留的微气泡与快速增长的菌体形成气溶胶现象，结构性粘度严重影响培养液的混和、传递特性。菌体生长与参数相关菌体生长时菌量必定增加，由于测定技术的困难，可用菌体干重、取样离心体积（PMV）、显示粘度、发酵液流出时间等表示。菌体生长时，OUR与CER发生变化。但是由于OUR与所利用的碳源的还原度有关，以及与菌体代谢途经密切相关，而CER主要涉及到碳平衡，所以一般宜以CER与菌体生长相关。氮源在菌体代谢过程中不能作为能源供应，因此氮源的变化一般与菌体的维持无关。但是菌体生长时，必需由氮源提供生长所需的N元素材料。菌体生长所引起的培养液流变特性的变化，由此而引起反应器混和传递特性的变化。KLa就是一个反映这种特性的较容易测定的特征参数。磷是菌体生长的重要因子，它既是菌体生长时的组成材料又是微生物进行平衡生长的限制因素之一，因此在培养液中测定总磷或溶磷含量是必要的，由此可以与其他生长有关的参数相关联。高搅拌转速时菌体生长与KLa变化高转速时的头孢C菌丝形态变化头孢菌素C发酵过程菌体生长引起的参数变化头孢菌素Ｃ发酵过程菌体生长与产量的关系金霉素发酵后期发酵液稀化现象发酵过程中泡沫与KLa的关系代谢引起的生物相关通过生物细胞及代谢途径的不同所引起的活性变化,直接对控制对象特性发生影响。菌体细胞代谢活性变化而直接引起的某测定参数的变化，即为代谢特性参数相关。----代谢强度的变化----代谢途径的变化----引起的基质消耗或代谢产物形成的不同代谢活性变化：环境条件的线性或动力学因素、细胞内某调节因子引起的代谢流迁移、基因水平的信息流。发酵过程中补糖策略的实施发酵过程中以某一营养物质作为限制性基质，采用营养物流加技术是常用的一种发酵调控策略。其中以流加糖（淀粉或葡萄糖）是最普遍采用的方法，归纳起来主要有以下几点理由。适应生物反应器的供氧能力，控制菌体生长速率与最大生物量。在菌体生长期完成后，在细胞水平控制比生长速率，使菌体酶体系处于最有利于生产的状态，或控制比生长速率来解决基因水平上的分解代谢产物的阻遏作用。低浓度葡萄糖可以降低高浓度时所引起的分解代谢阻遏作用。生物相关：排气氧浓度与溶解氧浓度的对应关系不同发酵周期的EO2浓度与DO的几种对应关系。这种不同的对应关系是与不同操作条件和菌体呼吸强度有关的。rpmDOECO2EO2加糖加糖ECO2ECO2ECO2EO2EO2EO2DODODOrpmrpmrpmhhhh非碳源限制，临界氧浓度以下（ＤＯ变化不显著）碳源限制，临界氧浓度以下（ＤＯ变化显著）非碳源限制，临界氧浓度以上（EO2变化不显著）碳源限制，临界氧浓度以上（EO2变化显著）补糖与排气CO2、pH的关系青霉素发酵过程，补糖将引起排气CO2浓度的增加和培养液pH下降，产生的二氧化碳和pH的变化可用下述简图描述：pHECO2加糖(h)产生的二氧化碳可以用青霉素产生菌的生长和产物形成的化学简式来说明：菌体生长：C6H12O6+NH3+3.3O2+0.06H2SO40.42C7.1H13.2O4.4N0.06S+3CO2+4.8H2O菌体维持：C6H12O6+6O26CO2+6H2O青霉素生产：C6H12O6+(NH4)2SO4+0.5O2+PAAC9H12O4N2S+2CO2+H2O糖对pH的影响主要从二个方面起作用，一方面，由于糖的补入，立即被菌体利用形成CO2，溶解的二氧化碳使培养液的pH下降，另一方面，糖被菌体利用以后产生有机酸。生物相关补糖与氮源的利用关系补料与磷含量的变化情况补料与物料平衡在菌体生长期或产物生产期，基础培养基中的碳源或中间补入的碳源被菌体利用后，经分解代谢和合成代谢，形成菌体生长、中间代谢物和能量消耗，这些都应符合物质平衡和能量平衡原理。----可把生物反应器中微生物细胞活动用化学元素的平衡式来表示。在多参数趋势曲线基