胡萝卜组培实验报告

本科学生综合性实验报告学号：姓名：学院：生命科学学院专业、班级：班实验课程名称：胡萝卜肉质根愈伤组织诱导、继代增殖、细胞悬浮及体细胞胚胎发生培养实验教师：开课学期：至学年学期填报时间：年月日云南师范大学教务处编印一．实验设计实验序号实验一实验名称胡萝卜肉质根愈伤组织诱导、继代增殖、细胞悬浮及体细胞胚胎发生培养实验实验时间2013年3月-6月实验室325实验内容：实验1-1MS培养基母液的配制与保存实验1-2MS固体培养基配制实验1-3胡萝卜肉质根愈伤组织诱导培养（初代培养）实验1-4胡萝卜愈伤组织培养实验1-5胡萝卜愈伤组织继代增殖培养实验1-6胡萝卜细胞悬浮培养实验1-7胡萝卜愈伤组织器官分化培养一．实验目的1-1：使学生能熟练准确配制MS培养基母液和组培室常用的化学试剂，巩固相关理论基础知识。1-2：通过MS固体培养基的配制，掌握配制培养基的基本技能。1-3：使同学能够熟练掌握外植体的表面消毒技术和无菌操作技术，并且基本掌握愈伤组织的诱导培养。1-4：使同学熟练掌握愈伤组织培养的基本操作技术，进一步熟悉、规范无菌操作技术。1-5：使同学熟练掌握愈伤组织继代增殖培养的基本操作技术，进一步熟悉、规范无菌操作技术。1-6：使同学熟练掌握胡萝卜细胞悬浮培养的基本操作技术，进一步熟悉、规范无菌操作技术。1-7：使同学了解胡萝卜愈伤组织器官分化培养的基本操作技术。二、实验原理、实验流程1.实验原理植物细胞全能性是植物组织培养的细胞基础。生活的植物细胞只要有完整的膜系统和细胞核，它就会有一整套发育成一个完整植株的全部遗传信息，在适当条件下，这些信息可以表达，再生成一个完整植株。1-1：培养基是植物离体培养组织和细胞赖以生存的营养基质。配制培养基时，为了减少试剂称取时的工作量和少量称取时出现的误差，以及避免多种营养成分混合导致沉淀产生或相互反应而失去培养效果，预先要将各种营养成分配制为一定倍数的培养基母液，待使用时稀释到要求的浓度。母液的浓度为培养基浓度的10倍、20倍、50倍、100倍等或更高。1-2：将事先配制好的培养基母液按一定比例稀释至浓度为培养基中规定的使用浓度，再加入琼脂、蔗糖、生长调节物质等，制备成符合要求的培养基。1-3：将胡萝卜的贮藏根（根的变态）表面消毒后切割成小块接种于愈伤组织诱导培养基上，诱导外植体脱分化产生愈伤组织。1-4：将胡萝卜肉质根诱导产生的愈伤组织，在无菌操作室中切取长势好的愈伤组织部分转接到胡萝卜愈伤组织培养基中，进行胡萝卜愈伤组织培养。1-5：将胡萝卜愈伤组织转接到愈伤组织继代增殖培养基上培养，即可实现愈伤组织的增殖。1-6：将增殖的大量胡萝卜愈伤组织转接到胡萝卜悬浮培养基中进行培养。1-7：将增殖的大量胡萝卜愈伤组织转接到胡萝卜愈伤组织器官分化培养基中培养。2.实验流程（1）实验总体流程：MS培养基母液的配制与保存MS固体培养基配制胡萝卜肉质根愈伤组织诱导培养（初代培养）胡萝卜愈伤组织培养胡萝卜愈伤组织继代增殖培养胡萝卜细胞悬浮培养胡萝卜愈伤组织器官分化培养（2）MS培养基母液的配制与保存流程：（3）MS固体培养基配制流程：大量元素母液的配制微量元素母液的配制有机成分母液的配制铁盐母液的配制植物生长调节物质母液的配制放入冰箱保存培养基各种物质的混合定容调整PH：6培养基分装培养基封口培养基灭菌培养基保存备用（4）胡萝卜肉质根愈伤组织诱导培养（初代培养)流程：(5)胡萝卜愈伤组织培养流程：（6）胡萝卜愈伤组织继代增殖培养流程：（7）胡萝卜细胞悬浮培养流程：外植体表面灭菌前的准备工作实验材料的准备器械及实验者的消毒灭菌、植物材料的表面灭菌和接种器械及实验者的消毒灭菌剥离愈伤组织诱导培养所得的愈伤组织胡萝卜愈伤组织接种器械及实验者的消毒灭菌胡萝卜愈伤组织培养所得愈伤组织接种于胡萝卜愈伤组织继代增殖培养的培养基中胡萝卜愈伤组织继代增殖培养所得愈伤组织接种于胡萝卜细胞悬浮培养的培养基中，在摇床中震荡器械及实验者的消毒灭菌(8)胡萝卜愈伤组织器官分化培养流程：三、实验设备及材料1、实验材料新鲜的胡萝卜贮藏根2、实验设备（1）主要用具与仪器：烧杯、容量瓶、搪瓷杯、药勺、称量纸、玻棒、标签纸、pH试纸（pH5.4~7.0），冰箱、普通天平、分析天平、各种型号的试剂瓶（棕色和白色）、移液管、量筒、子、手术剪、解剖刀、已灭菌培养皿、酒精灯、超净工作台、恒温培养箱、摇床、电磁炉、果酱瓶、高压蒸汽灭菌锅、封口膜、棉线、酒精棉球、已灭菌滤纸、镊培养架等。（2）主要药品和试剂：盐酸吡哆素、烟酸、肌醇、2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、NAA（α-萘乙酸）、硝酸铵、硝酸钾、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、碘化钾、硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、乙二胺四乙酸二钠、硫酸亚铁、甘氨酸、盐酸硫胺素、6-BA（6-苄基腺嘌呤）、KT、浓盐酸、氢氧化钠、浓硫酸、重铬酸钾、95%酒精、蒸馏水、琼脂、蔗糖、生长调节物质、蒸馏水、1mol·L-1HCl、1mol·L-1NaOH、无菌水、75％酒精、0.1%HgCl2。四、实验方法步骤1.MS培养基母液的配制（1）大量元素母液的配制与保存器械及实验者的消毒灭菌胡萝卜愈伤组织继代增殖培养所得愈伤组织接种于胡萝卜愈伤组织器官分化培养的培养基中母液种类成分规定用量/mg•L-1浓缩倍数称取量/mg母液定容体积/ml配1LMS培养基吸取取量/ml大量元素KNO319002038000100050NH4NO3165033000CaCl2•2H2O4408800MgSO4•7H2O3707400KH2PO41703400配制的步骤为：确定母液的浓度和体积→计算各种化合物用量→称量→分别溶解→混合→定容→装瓶→贴标签→放入冰箱保存。CaCl2•2H2O最后加入。（2）微量元素母液的配制母液种类成分规定用量/mg•L-1浓缩倍数称取量/mg母液定容体积/ml配1LMS培养基吸取量/ml微MnSO4•H2O16.93380ZnSO4•7H2O8.61720量元素H3BO36.2200124010005KI0.83166Na2MoO4•2H2O0.2550CuSO4•5H2O0.0255CoCl2•6H2O0.0255配制步骤同大量元素（混合时不要求先后顺序）。（3）有机成分母液的配制配制的步骤为：确定母液的浓度和体积→计算各种化合物用量→称量→溶解→定容→装瓶→贴标签→放入冰箱保存。(4)铁盐母液的配制母液种类成分规定用量/mg•mL-1称取量/mg母液定容体积/ml有机成分甘氨酸2.0200100VB11.0100VB61.0100烟酸1.0100肌醇101000铁盐母液宜单独配制，其配制步骤为：确定母液的浓度和体积→计算各种化合物用量→称量→分别溶解→混合→煮沸数分钟→调节pH值至5.8→定容→装瓶（棕色）→贴标签→放入冰箱保存。（5）植物生长调节物质母液的配制母液种类成分称取量(mg)母液定容体积(ml)母液浓度(mg/ml)生长素2,4-D1001001.0NAA细胞分裂素6-BAKT配制步骤与有机成分母液的配制步骤基本相同，但是2,4-D/NAA用少量95％酒精溶解，再加水定容；6-BA/KT应先溶于少量1mol·L-1的HCl中，再加水定容。2.MS固体培养基配制培养基配方：MS基本培养基＋6-BA0.4mg/L＋KT0.2mg/L＋NAA0.2mg/L＋2,4-D1mg/L+琼脂0.7％＋蔗糖3％＋CH100mg/LPH=5.8大量元素:25ml；微量元素：2.5ml；铁盐：2.5ml；肌醇：5ml；VB1：0.5mLVB6：0.25mL；盐酸：0.25mL；甘氨酸：0.5mL；BA：0.2mlKT：0.1mL；NAA：0.1mL；2,4-D：0.5mL母液种类成分规定用量/mg•L-1浓缩倍数称取量/mg母液定容体积/ml配1LMS培养基吸取量/ml铁盐Na2EDTA•2H2O37.320037305005FeSO4•7H2O27.82780CH：50mg；蔗糖:15g；琼脂：3.5g。每组配500mL,50mL三角瓶分装20瓶，25mL/瓶。方法步骤：（1）培养基各种物质的混合A.琼脂的溶解3.5g+350mLH2OB.称取所需蔗糖量加入到琼脂溶液中溶解（15g）C.按母液顺序和规定量依次量取母液并放入烧杯，并把混合母液加入到琼脂和糖的溶液内。（2）定容：500mL（3）调整PH：6（4）培养基分装（20瓶，25mL/瓶）（5）培养基封口（6）培养基灭菌（7）培养基保存备用3.胡萝卜肉质根愈伤组织诱导培养（初代培养）所用培养基为之前配制好的.MS固体培养基。（1）、实验材料的准备①、材料的修整、刷洗、冲洗。②、用小刀刮去胡萝卜外表皮，横切取高约1cm的圆柱形胡萝卜块3块。（2）、准备工作①、打开超净工作台和无菌操作室的紫外灯，照射40min左右，后关闭。②、开启过滤室风机，使无菌风吹拂工作台面和四周的台壁。③、用70%—75%的酒精擦拭工作台和双手。④、用沾有70%—75%酒精的纱布擦拭盛培养基的培养器皿，放进工作台。⑤、把解剖刀、剪刀、镊子等器械浸泡在95%的酒精中，再在火焰上消毒，放在器械架上。⑥、在酒精灯火焰附近切割备用的接种材料。⑦、打开瓶口，用火焰烧瓶口，转动瓶口使瓶口各部分都烧到。⑧、取下接种器械，在火焰上消毒。（3）、植物材料表面的灭菌与接种①、工作人员消毒。②、装材料的容器及玻璃棒用酒精进行表面消毒。③、将待消毒材料浸入75%酒精中2秒钟。④、移入消毒液0.1%HgCl2并计时。（10min）⑤、倒入无菌水清洗4次后备用。（4）、接种与培养①、将经消毒的胡萝卜块去除外侧部分后，每一块再切成四小块，分别接种到5个盛培养基的三角瓶内。②、培养瓶封口后置于恒温培养箱中全黑暗培养。温度控制在25℃左右。③、接种结束后，清理和关闭超净工作台。4.胡萝卜愈伤组织培养胡萝卜愈伤组织培养基的配制与胡萝卜肉质根愈伤组织诱导培养基的配制方法相同。在无菌操作条件下，用解剖刀剥离愈伤组织诱导培养所得的愈伤组织，接种于胡萝卜愈伤组织培养的培养基中，进行培养。5.胡萝卜愈伤组织继代增殖培养：首先要配制胡萝卜愈伤组织继代增殖培养基，其配置方法和培养基配方与MS固体培养基基本相同，只是胡萝卜愈伤组织继代增殖培养基中少了KT，且各种物质的含量与MS的相比有所不同。（1）、准备工作接种室的清洁和消毒；超净工作台的开机和消毒；剪刀、镊子、已灭菌培养皿和滤纸、待用培养基等的准备；实验材料的准备（选择装有无污染的胡萝卜愈伤组织培养所得愈伤组织三角瓶摆放于超净工作台）。（2）愈伤组织继代培养将无污染的胡萝卜愈伤组织培养所得愈伤组织转接到愈伤组织继代诱导培养基上（两瓶），封口后放置在25℃全黑暗条件进行愈伤组织的继代培养，以获得足够的愈伤组织，作为后续实验的实验材料。6.胡萝卜细胞悬浮培养培养基配方：MS基本培养基＋1mg/L2,4-D＋0.5mg/L6-BA＋200mg/L水解酪蛋白＋3％蔗糖（事先已配好）配制方法与MS固体培养基相同。将胡萝卜愈伤组织继代培养所得的两瓶无污染的愈伤组织，在超净工作台中，转接2/3到胡萝卜细胞悬浮培养的培养基中，在摇床中震荡，进行培养。7.胡萝卜愈伤组织器官分化培养配方：MS基本培养基＋0.1mg/LNAA＋1mg/L6-BA＋0.7％琼脂＋3％蔗糖（配制方法同上）将胡萝卜愈伤组织继代培养所得的两瓶无污染的愈伤组织，在超净工作台中，转接1/3到胡萝卜愈伤组织器官分化培养的培养基中进行培养。五、注意事项1、调节培养基时，理论上应调至5.8为宜，但因培养基经高温高压灭菌时，蔗糖分解，PH值会有所下降，因此调至6.0可减小误差。2.防火。实验中要经常用酒精消毒、用酒精灯烧镊子、刀具，注意安全。3.无菌操作。材料经HgCl2消毒后，即认为是消毒干净，此后的操作中的用具要求无菌。为防止染菌，注意：手要用酒精擦干净；镊子和刀经常在火焰上烧；锥形瓶、手不要放在盛材料的培养皿上方。4.废液处理。酒精要回收，放原处；HgCl2有剧毒，小心不要溅出，废液使用后应按要求放到指定位置。5.实验