分子诊断及其临床应用

分子诊断及其临床应用分子诊断：利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接从DNA/RNA水平检测基因结构及其表达水平是否正常，分析致病基因的存在、变异和表达状态从而对疾病作出诊断。优点早期诊断特异性强灵敏度高适用性强移植配型HLA分型分子诊断技术平台及其应用感染性疾病病原微生物鉴定，定量，分型，耐药检测亲权鉴定遗传性疾病基因突变：单基因病遗传风险因素肿瘤诊断，分型，治疗检测，耐药PCR分子诊断技术实时荧光PCR测序，片段分析杂交，芯片MLPA熔点曲线…临床常用的分子诊断技术：PCR扩增（临床最常用）探针杂交技术测序技术片段分析技术等分子诊断技术：实时荧光定量PCR技术PCR-探针杂交技术PCR-测序技术PCR-SSCP（单链构象多态性）PCR-RFLP（限制性片段多态性）PCR-DGGE（变性梯度凝胶电泳）……科研为主临床科研常用PolymeraseChainReaction聚合酶链式反应基因体外扩增技术PCR技术1循环=2扩增子2循环=4扩增子3循环=8扩增子4循环=16扩增子5循环=32扩增子6循环=64扩增子7循环=128扩增子循环数扩增子数(靶序列拷贝数)122438416532664201,048,576301,073,741,824(10亿)链式反应－－分子爆炸实时荧光（定量）PCR定义：在PCR反应体系中，加入示踪产物的荧光分子（荧光标记的寡核苷酸探针或荧光染料），利用荧光信号的累积对PCR反应过程实时监控，最终对初始模板进行定量的方法。普通PCR荧光定量PCR常规PCR技术：对PCR扩增反应的终产物进行半定量及定性分析定量PCR技术：对PCR扩增反应中每一个循环的产物进行定量及定性分析实时荧光（定量）PCR荧光示踪方法•荧光染料法：SYBRGreen1，EB•荧光探针法：基于FRET(荧光共振能量转移)技术Taqman(水解探针)Hybridizationprobe(杂交探针)MolecularBeacon(分子信标)SYBRGreenl检测模式18•是一种能与双链DNA结合发光的荧光染料。•结合于双链核酸的小沟处，与双链DNA结合后受激产生荧光•在变性条件下双链分开，荧光消失,通常在PCR的延伸阶段检测荧光•缺点：没有特异性，只要是双链就会结合发光，因此对非特异性扩增和引物二聚体也会产生荧光。•优点：通用性好，价格低；产物可作熔点曲线分析。发生条件：1.供、受体分子空间位置上相互临近.2.受体分子的激发光谱必须与供体分子的发射光谱相互重叠荧光共振能量传递：FRET(flouresenceresonanceenergytransfer)在一定距离内淬灭基团可以吸收荧光基团发出的荧光并以更长的波长或热量的形式发射出去，这一过程称为荧光共振能量传递（FRET）RQRQReporterQuencher目标特异性探针在PCR的延伸阶段检测荧光Taqman探针（水解探针）5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团，探针完整时，没有荧光，探针断裂后，在激发光的作用下，荧光基团产生荧光；探针本身序列与目的基因序列互补，特异性高，退火后探针与目的基因互补序列结合，随着PCR反应的进行，在Taq酶5’---3’外切酶的作用下，探针水解断裂，荧光产生。RQ-PCRTaqMan探针应用：定性及定量各种病原微生物的分子鉴定：HBV、HCV、HIV、NG、CT、UU、HCMV、EB、TB、HPV、BKV、HSV……血液病相关融合基因检测：BCR-ABL、PML-RARa、AML-ETO……相关基因表达定量：G6PDH、ERCC1、P53、HER2……其他：SRY基因检测……杂交探针（HybridizationProbes）模式FluoresceinLCRed22由两条相邻的寡核苷酸探针组成，一条探针的3’标记荧光基团（供者），另一探针的5’标记另一荧光基团（受者）。当退火复性时，探针结合在模板上，供受基团相邻，外光源激发供体基团时，通过FRET使受体基团发出荧光，可供检测。当延伸时，两探针被置换，游离出来，失去FRET结构，无可检测荧光。在PCR的复性阶段检测荧光分子信标molecularbeacon）分子信标是一种茎环结构的双标记寡核苷酸探针。分子信标的茎环结构中，环一般为15-30个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般5-7个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端。在此结构中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。此时，荧光基团与淬灭基团形成FRET结构，致荧光淬灭。在变性后退火复性过程中，分子信标与靶DNA结合，茎环结构打开成链状，荧光基团与淬灭基团分开，产生荧光。分子信标探针在变性后退火复性过程中，分子信标与靶DNA结合，茎环结构打开成链状，荧光基团与淬灭基团分开，产生荧光。艾德公司特异引物双环探针技术EGFR、K-ras等突变QIAGEN公司DxS蝎子探针技术优点：突变含量低至1%亦可检出。EGFR突变检测、K-ras突变检测……molecularbeacon探针：特异性好，背景信号低，扩增效率高，不能做溶解曲线分析，适合定性、定量及基因突变分析。实时荧光定量PCR中的三个概念•增长曲线(primarycurve)•荧光阈值（threshold)•CT值(CycleThreshold)增长曲线反映荧光强度与循环数的对应关系CycleFluorescence起始模板浓度的对数与C(t)值成线性反比关系每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。起始拷贝数越多，CT值越小；模板DNA的起始拷贝数越少，CT值越大。荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的方法•定量PCR方法可分为外标法和内标法•定量类型可分为绝对定量和相对定量绝对定量通过外标准品定量•绝对定量的标准样品：已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。标准样品的种类：••含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒••含有和待测样品相同扩增片段的cDNA••PCR的产物初始DNA量越多,荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少在扩增检测待测样本的同时，扩增一系列已知标准（通常为质粒DNA），根据扩增曲线的Ct值与该扩增反应模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，则可推导出同时扩增的待测样本中初始模板量。RQ-PCR中的绝对定量：确定样本中靶DNA的绝对含量外标法：使用外部标准曲线的方法（绝对定量）在扩增检测待测样本的同时，扩增一系列已知标准（通常为质粒DNA），根据扩增曲线的Ct值与该扩增反应模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，则可推导出同时扩增的待测样本中初始模板量。定量PCR的数学原理斜率与扩增效率使用外标定量的要求以外标准进行定量，必须在扩增的指数期进行；Threshold尽量处在刚刚进入指数扩增期阶段扩增指数期取决于PCR模板的相对量使用外标的定量PCR方法的优缺点•优点：（1）方法简便，容易建立；（2）使用双孔重复测定，这种方法可得到非常准确的结果，甚至可排除管间的差异，但不能排除样本间的差异；•缺点：PCR反应体系中小的区别也会对测定造成较大的影响。由于最后在扩增效率上的差异，从而使得定量测定精密度和重复性不佳。•因此，如果建立一个使用外标准的PCR定量方法，则必须进行方法的精密度（批内变异）和重复性（批间变异）分析，以确定其应用的局限性。定量测定的结果报告定量测定测定的是量的“多”或“少”；定性测定则是测定某种物质的“有”或“无”，用于未知病人的确认诊断。定量测定结果报告：根据所使用的测定方法的测定范围报告结果，如样本测定结果高出此范围，则可报告多少，也可对样本稀释后再检测；如低于此范围，则报告多少，如103拷贝数/ml，而不能报告为0拷贝数/ml或阴性。相对定量通过内标定量•内标（EndogenousControl）通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因•在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小•内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量RQ-PCR中的相对定量即测定同一样本中两种不同基因量的比率或不同样本中同一基因量的比值主要用于基因表达检测，疗效观察等例：CML病人的BCR-ABL融合基因检测使用管家基因G6PDH或ABL例1：目的基因Acopies/ml管家基因Bcopies/mlA/B%或治疗前A基因copies/ml治疗后A基因copies/ml治疗后/治疗前%相对定量结果的报告一、分子诊断在感染性疾病中的应用在病原微生物方面的应用•快速鉴定实时荧光PCR方法淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、结核杆菌、高危型HPV病毒、HSV病毒等•定量分析实时荧光PCR方法HBV、HCV、HIV、BK、EB、HCMV等•病毒分型PCR-测序法HBV病毒分型、HCV病毒分型•耐药分析HBV病毒四种耐药分析PCR-测序法结核杆菌耐药基因突变分析探针杂交技术RT-PCR进行HBVDNA载量分析的实验流程DNA提取RT-PCR血清分离人工上样检测报告患者1,男，22岁，慢性乙肝患者，于2010年11月起定期在我院进行HBV血清学及DNA含量检测，相关实验室数据如下:乙肝两对半结果：项目2010．11.272011.2.12011.6.152011.10.232012.1.7单位阴性判断值乙肝表面抗原半定量3000.00阳性3000.00阳性3000.00阳性3000.00阳性3000.00阳性COI0-1.0乙肝表面抗体定量2.00阴性2.00阴性2.00阴性2.00阴性2.00阴性IU/L0-10.0乙肝e抗原半定量10.05阳性7.23阳性0.57阴性2.69阳性0.92阴性COI0-1.0乙肝e抗体半定量2.50阴性1.34阴性0.87阳性1.62阴性0.71阳性COI1.01乙肝核心抗体半定量0.78阳性0.54阳性0.60阳性0.49阳性0.50阳性COI1.0高精度HBVDNA含量检测结果：0.00E+005.00E+031.00E+041.50E+042.00E+042.50E+043.00E+042010.11.272011.2.12011.6.152011.10.232012.1.7IU/mlcopies/ml患者2，男，29岁。慢性HBV感染者。2009年8月，初次进入华西医院感染科就诊，查HBVDNA载量为1.2E+07cp/ml，两对半检测为135阳性；HBV基因型检测为B型，未耐药；后经过拉米夫定抗病毒治疗3月，复查HBVDNA载量为2.3E+04cp/ml；后继续服用拉米夫定，半年后，查HBVDNA载量为5.8E+02cp/ml；后继续抗病毒治疗，3月后，继续复查高精度HBV，结果为70cp/ml。说明抗病毒治疗效果显著。医生建议其继续服用拉米夫定，半年后继续复查HBVDNA载量。2011年5月，听取医生建议继续复查HBVDNA载量。检测结果为5.8E+03CP/ml，说明HBV继续活跃复制，可能由于基因耐药所致。。。。。哈拉尔德·楚尔·豪森-----2008年诺贝尔获得者•持续的人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)感染是引起宫颈癌和癌前病变的必要因素，93.0%-99.7%的宫颈癌组织中均可检测到HPVDNA。•高危型HPV的持续感染可使患宫颈癌的风险增加250倍。细胞学检查结果为意义不明确的非典型细胞时，HPV基因的检测能预测受检者患宫颈癌的风险。细胞学检查+HPV基因的检测是宫颈癌前病变和宫颈癌筛查的最佳方法，成为预防宫颈癌的关键。二、分子诊断在肿瘤中的应用在肿瘤及血液病方面的应用•诊断JAK2V617F突变检测实时荧光PCR方法白血病融合基因筛选（BCR-ABL、PML-RARa等）IgH及TCR基因重排分析PCR+毛细管电泳……•个体化治疗高敏法EGFR基因29种突变分析实时荧光PCR方法高敏法Kras基因7种突变分析AML相关预后基因突变分析PCR-测序法……Case•患者,女，54岁，某公司职员，以“咳嗽，痰中带血2月余”就诊，查影像学显示“右肺中央型