实验室做细胞常用的细胞固定及染色方法(详细)

实验室做细胞常用的细胞固定与染色方法一、爬片前盖玻片处理方法对于悬浮培养的细胞，在进行各种染色前常需先制备成涂片。为了保证细胞在长时间的染色过程中不从载玻片脱落，必须使其牢固贴附于载玻片上。在载玻片上涂布一层有助于细胞黏附的物质是经常采用的方法之一。能促进细胞黏附的物质主要有多聚赖氨酸、铬矾明胶等，这里介绍多聚赖氨酸的涂布方法。1、将载玻片用玻璃专用洗涤剂(如Decon)浸泡5min，间或振荡。2、用自来水冲洗5min。3、以1％盐酸—70％乙醇溶液浸泡5min。4、烤箱干燥(至此即可用于普通染色)。5、多聚L-赖氨酸(1:10溶于去离子水)浸泡5min，振荡。6、入60℃烤箱1h，或室温过夜干燥(用于细胞化学、免疫细胞化学及原位杂交细胞化学)。二、细胞固定常用方法固定细胞的目的在于把组织和细胞的原有结构尽可能完整地保存下来，避免组织和细胞发生降解、自溶、腐败和变形等，使细胞和组织内的各种酶失去活性，防止细胞和组织的各种分子变性、解离，使细胞的化学物质和酶能准确定位，并在以后的处理和制片过程中亦不发生改变和破坏。同时，固定还可使细胞的各部分易于着色，适于观察、长期保存和分析。1.固定组织、细胞的基本原则：尽可能选用新鲜培养物；根据检测工具、对象、目的和要求选择固定剂和固定方法。2.培养物的准备和固定前处理：各种细胞培养物，如双盖片悬滴培养物、悬液培养物、单层培养物和盖片单层培养物都可作固定材料。对双盖片悬滴培养物和悬液培养物来说，常通过离心收集细胞，PBS漂洗2～3次后，备固定制片；对盖片单层培养物来说，将盖片从培养器皿中取出后，PBS液漂洗2～3次，以洗去血清和附着于细胞表面的残渣，备固定用。3.常用固定液：常用的固定液分两类，一类是以单一化学物质配成的固定液，称简单固定液。主要有甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、丙酮、戊二醛、苦味酸、铬酸、重铬酸钾、氯化汞、氯化镉、四氧化锇(锇酸)。另一类是用两种或两种以上化学物质配合成的固定液，称混合固定液。如Mueller固定液、Flemming固液、FAA固定液、Carnoy固定液、Rossman固定液、Altmann固定液、Bouing固定液等。不同的固定液对细胞的化学成分、酶类及细胞结构固定效果不同。因此，选择合适的固定液是达到固定目的的基础。(1)4％甲醛-PBS:甲醛是一种气体，其饱和水溶液无色，约含40％甲醛。在很多情况下，甲醛常常产生多聚甲醛的白色沉淀。4％甲醛-PBS使组织变硬速度比乙醇快，并能较好地保存组织的外部形式，固定效果不受制片影响，固定材料可用苏木精和其他合成染料染色。甲醛的穿透力较强，对组织固定均匀，能增强组织的弹性，大标本的固定和保存多用甲醛。甲醛是染色体、线粒体和高尔基体的固定液，在冷冻切片中，甲醛作固定剂具有显著的优点。用40％甲醛水溶液:PBS=1:9配方制备甲醛固定液。(2)丙酮：丙酮为无色易挥发液体，用纯冷丙酮(4℃)固定细胞内酶效果较佳。(3)乙醇：乙醇又称酒精，固定血纤维蛋白、色素、弹性纤维、细菌和白细胞等效果优良。无水乙醇或乙醇和醋酸的混合液是固定肝糖原及肌糖原的良好固定液。乙醇除有固定作用外，还具有硬化和脱水的作用。作为固定用乙醇的适宜浓度为70％～100％。乙醇的缺点是渗透力差，并使组织收缩。(4)醋酸：常用0.3％～5％浓度的醋酸作固定剂。醋酸能和水及乙醇、甲醇溶合，醋酸不固定蛋白质，但能固定核酸。醋酸的穿透力很大，它对细胞的膨胀作用显著，这是由于它破坏了某些蛋白质分子的结合，所以，常用醋酸来减少其他固定剂引起的细胞收缩。细胞学技术中，它能防止细胞收缩，并能较好地保存染色体，还能把染色质沉淀成为可染色的块状体。(5)苦味酸：苦味酸是黄色结晶体，强酸，可溶于水、乙醇、苯和二甲苯，在水中的溶解度可因水温变化而变化。苦味酸可以沉淀白蛋白、核蛋白、球蛋白、组蛋白和核酸。苦味酸的穿透力很慢，单独使用时，造成组织严重收缩。它和其他药物混合配制时，可以作为蛋白质的沉淀剂，同时可避免组织收缩、硬化，而且易于染色。所以在很多混合固定液中被广泛采用。作固定用的最适浓度为1％。(6)锇酸(四氧化锇)：锇酸是一种强氧化剂，不能同乙醇和甲醛混合使用。它的挥发性很强，挥发出来的气体能固定结膜，对眼睛很有害，所以操作时应特别注意。四氧化锇是保存细胞结构的最好固定剂之一，配制时先在棕色试剂瓶中盛入50～100ml0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0～7.4)，再将装有1g锇酸的安培瓶放人PBS中，以玻棒击碎安培瓶，摇荡使锇酸溶解，备用。常用的固定液浓度为1％～2％。(7)戊二醛：戊二醛对组织的渗透率高，与蛋白质反应快，能较好地保存蛋白质，对微管和膜性结构保存亦比较好，并能较好地保存糖原。常用的戊二醛固定液配制方法列于表12-1。表12-1常用的戊二醛固定液配制方法Ph7.2的0.1mol/L磷酸缓冲液（ml）969692908825%戊二醛水溶液（ml）4681012戊二醛的终浓度1%1.5%2%2.5%3%(8)甲醇／醋酸固定液：甲醇：醋酸为3:1的固定液是应用最广的一种培养细胞固定剂。甲醇穿透力好，醋酸固定蛋白效果好，两者结合，能使固定细胞形态不变。不仅最适用于固定染色体，而且固定的染色体适于Giemsa染色(注意：此固定液宜现用现配)。(9)FAA固定液：此固定液适用于固定盖片单层培养的细胞，固定效果好。配制方法：90ml80％酒精中加5ml冰乙酸和5m140％甲醛。(10)Carnoy固定液：Carnoy固定液是较好的非水溶性固定液，是显示细胞化学成分(如粘多糖等)时常用的固定剂，固定、保真效果好，但穿透力差，适于固定培养的单层细胞。配制方法：60ml纯酒精加30ml氯仿和10ml冰乙酸。(11)Bouin固定液：用于固定双盖片法培养的标本，固定30分钟后，用70％酒精褪去苦味酸黄色，如不立即染色，可将标本保存在70％酒精中。本试剂适于固定组织细胞的糖原。配制方法：先将75ml饱和苦味酸(100ml水中加1.2～1.4g)过滤，加入25ml福尔马林(40％甲醛，有沉淀时禁用)，最后加入5ml冰醋酸，混和后存于4℃冰箱中备用。冰醋酸最好在临用前加入。该固定液对组织细胞穿透力较强，固定效果较好，保存的细胞结构完好。但因偏酸(pH为3～3.5)，对抗原有一定损害。(12)4％多聚甲醛-PBS固定液：多聚甲醛为白色固体，在50ml蒸馏水中加入4g多聚甲醛，加热至60～70℃时，边搅拌边逐滴加入2mol/LNaOH，至液体清晰透明。用1mol/LHCl调节pH至7.4，冷却后加入0.01mol/LPBS液至100ml，4℃保存。本试剂适于固定肾纤维蛋白和细胞骨架蛋白。三、常见的细胞染色方法1普通染色观察苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色和Giemsa染色是观察培养细胞一般形态的最常用方法，也是把细胞作为标本保存的主要方法。对于贴壁培养的细胞，以生长于盖玻片和塑料培养瓶壁者便于操作。固定前先用Hanks液、PBS、BSS或生理盐水清洗培养物2次，去除妨碍染色的血清。固定后可将盖玻片用树胶贴于载玻片上，以利操作。对于悬浮培养细胞，须先经离心沉淀(1000r／min，10min)，弃上清液后(留少量液体)，将细胞悬液滴于玻片上做成涂片，冷风吹干。1.1HE染色法1.1.1染液配制(1)苏木精染液：这里介绍鄂征(1995)改良的Mayer法。称取0.5g苏木精，5.0g铵矾或钾矾，0.1g碘酸钠加温溶于70m1蒸馏水。再加入30ml甘油，2ml冰醋酸。混匀。过滤后即成母液。可长久保存。用蒸馏水以1:20稀释即成工作液，可用很长时间。每次染色前宜过滤，去除氧化膜。(2)伊红染液：伊红有醇溶性与水溶性之分。将0.5g伊红溶于100m170％乙醇或蒸馏水即成工作液。1.1.2染色程序（1）用10％甲醛(福尔马林)固定培养物30min，或以丙酮固定15min。（2）蒸馏水洗1次后，入苏木精染液5～10min染细胞核。（3）入0.5％盐酸-70％乙醇溶液30～1min，脱去胞质的着色。此时核呈紫红色。（4）入碱性溶液碱化，使细胞核变成蓝色。如果时间允许，最好用自来水(呈弱碱性)长时间浸泡。也可入1％NaHCO3溶液。此过程须不断用显微镜监视，以掌握碱化时间。（5）蒸馏水洗1min，去除残留的碱性溶液，否则影响伊红着色。（6）入伊红染液30s～1min。（7）用梯度乙醇溶液脱水：70％、90％、95％乙醇各30s～1min；100％(2次)各2min。如伊红为乙醇溶液，略去70％乙醇。（8）用二甲苯透明2次，各5min。（9）树胶封固。1.1.3染色结果细胞核呈紫蓝色或深蓝色，大部分细胞的胞质呈粉红色。如果胞质内含较多核糖体(例如淋巴细胞)则亦呈蓝色。1.2吉姆萨染色法此法可将细胞核与胞质同时染色，故便捷快速；但染液配制技术不易准确掌握，效果常不如HE染色稳定。1.2.1吉姆萨(Giemsa)染液的配制（1）取1.5g吉姆萨粉末放入50ml甘油，置于60℃温箱，约3h后溶解。（2）取出后倒入50ml中性甲醇，即为母液。于棕色瓶可长久保存。需要注意的是，有的甲醇内含醋酸，会使染液中的伊红沉淀出来，不利染色。（3）将母液与0.1mol／LPBS(Ph6.9～7.2)按1:9混合即成工作液。吉姆萨染液对pH极敏感，偏酸时染色过红，偏碱时则过蓝。所以，工作液宜现用现配，保存时间不超过48h以免被CO2酸化。1.2.2染色程序（1）将标本用甲醇固定5～10min。（2）入吉姆萨液染色10～15min。可用染色缸；或将染液滴覆于标本。（3）蒸馏水清洗，空气干燥，二甲苯透明，树胶封固。1.2.3染色结果细胞核呈蓝或蓝紫色，胞质呈色与HE染色相仿。