Western-blot实验所需试剂配制方法

一．Westernblot实验所需试剂配制方法制胶试剂：1.30％（W/V）丙烯酰胺溶液：名称用量备注Acrylamide29gN-甲叉双丙烯酰胺(N，N-methylene-bisacylamide，BIS)1g充分搅拌溶解去离子水80ml定容至100ml，0.45μm滤膜过滤除杂，置于棕色瓶中4℃保存，（注意：丙烯酰胺具有强烈的神经毒性，通过皮肤吸收并具有累积性，配制时应戴手套操作）2.10％（W/V）过硫酸铵：名称用量备注过硫酸铵0.1g去离子水1ml现配现用（注意：10％过硫酸铵溶液在4℃保存能使用两周左右，过期会失去催化效果）3.1MTris-HCL,pH=6.8(36%的浓盐酸)：名称用量备注Tris12.1去离子水80ml浓盐酸8.8-9ml预实验已确定去离子水加入去离子水定容至100ml后，室温保存4.1.5MTris-HCL,pH=8.8(36%的浓盐酸)：名称用量备注Tris18.17去离子水80ml浓盐酸2.8-3ml预实验已确定去离子水加入去离子水定容至100ml后，室温保存5.10%SDS：名称用量备注SDS10g去离子水80ml加入去离子水定容至100ml后，室温保存缓冲液配置：6.5ⅹTris-GlycineBuffer(SDS-PAGE电泳缓冲液)名称用量备注pH=8.3Tris15.1gGlycine94.0gSDS5.0g去离子水800ml加入去离子水定容至1L后，室温保存7.1ⅹ膜转移缓冲液：名称用量备注Glycine2.9g2.9gTris5.8g5.8gSDS0g0.37g甲醇用前加200ml甲醇用前加200ml甲醇去离子水定容到1000ml定容到1000ml室温保存8.1ⅹ膜转移缓冲液：名称用量备注Glycine2.9g2.9gTris5.8g5.8gSDS0g0.37g甲醇用前加200ml甲醇用前加200ml甲醇去离子水定容到1000ml定容到1000ml室温保存9.5×SDS-PAGELoadingBuffer：名称用量备注1MTris-HCL,pH=6.81.25ml2.5mlSDS0.5g1g甘油2.5ml5mlBPB（溴酚蓝）25mg50mg超纯水至5ml10ml分装200ul/管50℃充分溶解，30min，离心取上清，0.45uM过滤2ME10ul/200ul使用前添加，添加后可室温保存一个月10.封闭缓冲液：名称用量备注脱脂奶粉5gTBST100ml充分溶解后，4℃保存其它：（备用）11.考马斯亮蓝R-250染色液：名称用量备注考马斯亮蓝R-2500.1g异丙醇25ml搅拌溶解冰醋酸10ml搅拌均匀去离子水65ml搅拌均匀，滤纸除去颗粒物，室温保存12.考马斯亮蓝染色脱色液：名称用量备注冰醋酸100ml甲醇100ml去离子水800ml充分混匀后使用13.2%的丽春红贮备液(20mL)：名称用量备注丽春红5g三氯乙酸0.4g磺基水杨酸6g充分溶解，定容20ml制胶：14、分离胶的制备（pH8.8）15、浓缩胶的制备（5%Acrylamide）