Western-Blot常见问题解析

WesternBlot常见问题解析问题可能原因解决方法凝胶未聚合。单体纯度不够。更换试剂。凝胶溶液中，有溶解氧，抑制了凝胶聚合。使用抽气泵抽出空气。过硫酸铵实效或量不够。应新鲜配制或换其他批号的过硫酸铵或增加溶液。加入水层时凝胶已聚合。聚合速度过快。1.加催化剂之前，冷却凝胶溶液，让聚合速度减慢；2.减少TEMED或过硫酸胺用量；3.加快操作。“微笑”(smiles)现象：即指示剂前沿呈现两边向上的曲线形。凝胶冷却不均匀，中间部分冷却不好，致使凝胶中的分子有不同的迁移率。更换凝胶。“皱眉”(frowns)现象：即指示剂前沿呈现两边向下的曲线形。常常是由于垂直电泳时电泳槽的装置不合适引起的，特别是凝胶和玻璃板组成的“三明治”底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全。更换凝胶由于拔梳子时产生负压的缘故，造成浓缩胶和分离胶交界处分离，且加样孔底部开裂。灌胶时梳子一定要是干燥的！梳子不要拔太快，可略左右晃动。电泳时间比正常要长。凝胶缓冲系统和电极缓冲系统的PH选择错误，及缓冲系统的PH和被分离物质的等电点差别太小或缓冲系统的离子强度太高。更换缓冲液沿指示剂向相反方向移动。电源连接的正、负极错置或缓冲液选择错误。检查电源连接的正、负极是否正确；或更换缓冲液。Westernblot结果中背景高且不均匀。使用的封闭液不兼容。更换一种不同的封闭液。膜封闭不够，非特异性位点封闭不足。1、选择更加适合的封闭液；2、提高封闭液中蛋白的浓度；3、优化封闭时间和/或温度；4、室温封闭至少1h或者4°C封闭过夜。抗体浓度太高。一抗或二抗浓度太高会导致高背景，降低抗体浓度。一抗孵育的温度偏高。4℃孵育过夜。抗体孵育不均匀。在孵育过程中始终进行震荡。洗涤不充分。增加洗涤次数和使用缓冲液的体积。缓冲液污染或结块沉淀。制备新的缓冲液；缓冲液使用前过滤。操作设备被污染。保证电泳仪器、印迹仪器和孵育用容器清洁，无外缘污染物；保证在转膜后没有凝胶留在膜上，蛋白可能黏在胶上导致背景。膜的曝光时间过久。缩短印迹膜曝光的时间。膜在实验过程中干过。保证膜完全被液体覆盖，保证膜始终是湿润的，避免其干燥。膜破损或污染。小心夹膜：损坏膜可能导致非特异性结合；不能空手持膜，始终带干净手套或用镊子。选择的膜容易产生高背景。一般硝酸纤维素膜的背景会比PVDF膜低。Westernblot结果中杂带较多。目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带。查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。目的蛋白有其它剪切本。查阅文献或生物信息学分析可能性。样本处理过程中目的蛋白发生降解。加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。上样量过高，太敏感。适当减少上样量。一抗或者二抗浓度偏高。降低抗体浓度。一抗特异性不高。重新选择高特异性的抗体。Westernblot结果中信号弱或无信号。蛋白未完全结合到膜上。1.确保转膜过程中胶与膜完全接触；2.确保转膜夹层排布正确；3.确保按照膜的制造商的使用说明润湿膜；4.确保转膜过程未过热；5.优化转膜时间和电流；6.在转膜缓冲液中加入20%的甲醇促进结合；7.低分子量的抗原可能会穿过转印膜，需使用小孔径的膜进行。抗体不足。增加抗体浓度；抗体可能失活。抗体浓度太高。使用太多一抗或二抗可能导致信号迅速消失，呈现出很弱的信号。抗原不足。1.加入更多的蛋白进行跑胶；2.抗原被封闭液掩蔽；3.试用不同的封闭液；4.优化封闭液中蛋白浓度。缓冲液中含有叠氮钠。叠氮钠是一种HRP的抑制剂，缓冲液不能使用叠氮钠作为防腐剂。曝光时间太短。延长曝光时间。底物孵育时间太短。进行5分钟的底物孵育。底物失活。重新加入底物；确保两种底物无交叉污染，两种底物试剂的污染可能导致活性下降。膜可以修复剥离重新检测。在膜剥离过程中可能会有抗原损失或变性，优化剥离程序；避免在同一张膜上重复进行检测。在膜上消解抗原，封闭底物可能含有蛋白水解酶活性。准备一张新的印迹膜。印迹膜保存时蛋白降解。准备一张新的印迹膜。检测样本不表达目的蛋白。选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性。检测样本低表达目的蛋白。提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。抗体不能识别测试种属的相关蛋白。确定抗体是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白一抗孵育时间不足。建议4℃孵育过夜。二抗与一抗不匹配。选择针对一抗来源的种属的抗体。洗膜过度。洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-20。目标带是空白，周围有背景。一抗浓度较高，二抗上HRP催化活力太强，同时显色底物处于一个临界点，反应时间不长，将周围底物催化完，形成了空白。降低一抗和二抗浓度，或更换新底物。膜上多处出现黑点或黑斑。抗体与封闭试剂发生非特异性的结合。更换一种不同的封闭液；交叉反应的检测。封闭一张干净的膜，与抗体一起孵育。蛋白分子量偏低或偏高。胶浓度不适合。改变凝胶浓度，高分子量要用低浓度胶；小分子蛋白要用高浓度胶。