抗体药物的质量控制方法

抗体药物产品质控方法概述2012.12目录（一）理化检测（二）生物学测定（三）非免疫球蛋白杂质分析1蛋白含量测定：Lowry法、双缩脲法（药典）原理：基于蛋白质在碱性环境中与Cu2+反应形成复合物，并与合适的试剂（Lowry：酚试剂；双缩脲：双缩脲试剂）形成有颜色且稳定的络合物，利用标准蛋白质作对照，采用紫外-分光光度法测定蛋白质含量。BCA法：基本原理与lowry，双缩脲基本相同BCA(bicinchoninicacid)钠盐是一种稳定的水溶性复合物，可与Cu+高度特异性结合，产生紫色复合物。该复合物在562nm处有最大吸光值，并与蛋白浓度成正比。以BSA为标准品求得标准曲线，进而计算未知蛋白样品的浓度2装量标示装量以重量计的产品以“重量法”检查装量，除另有规定外取供试品5个（50g以上者3个），除去外盖和标签，容器外壁用适宜的方法清洁并干燥，分别精密称定重量，除去内容物，容器用适宜的溶剂洗净并干燥，再分别精密称定空容器的重量，求出每个容器内容物的装量与平均装量，应符合规定。如有1个不符合规定，则另取5个（或3个）复试。溶剂通过半透膜由低浓度溶液向高浓度溶液扩散的现象称作渗透，阻止渗透所需施加的压力，即为渗透压。正常人体液渗透压为285~310mOsmol/kg，生理盐水和5%葡萄糖溶液与之相当。渗透压的测定一般由冰点降低法间接求得。通常采用测量溶液冰点下降来间接测定其毫渗透压摩尔浓度。①：△T=Km式①中，K--冰点降低常数，溶剂不同，K值不同，对水溶剂K=1.86；m--渗透压摩尔浓度。而渗透压符合：②：P'=K'm式②中，P‘为渗透压，K’为渗透压常数，m为溶液重量摩尔浓度。由于式①和式②中浓度等同，故可以用冰点下降法测定溶液的渗透压摩尔浓度。测定药物溶液的渗透压时，只要能测得药物溶液的冰点降低值，就可求出。对药物的注射剂、滴眼剂等，要求制成适合人体的等渗溶液。3渗透压美国Advanced公司Fiske210型冰点渗透仪4-1可见异物检查“可见异物系指存在于注射液和滴眼剂中，在规定条件下目视观测到的任何不溶性物质。”——《2010版药典》附录VB方法要点：1复溶冻干制剂，环境100级，方法按说明书2抽检量5支，去标签清除外壁污痕，静置一段时间（抗体制剂要过夜）3设备4人员要求：校正视力5.0以上，无色盲5无色溶液1000-1500lx，有色或透明塑料容器，2000-3000lx6标准6-2不溶性微粒检查法“本法在可见异物检查符合规定后，用以检查静脉注射剂（溶液型注射液、折射用无菌粉末、注射用浓溶液）及供静脉注射用无菌原料药中不溶性微粒的大小及数量。”——《2010版药典》附录VI方法要点：光阻法1环境要求100级2溶剂要求用不大于1.0μm的微孔滤膜过滤3外壁洗净后按要求复溶样品4静置2分钟或适当时间（抗体不超过4小时）脱气5依法测4支或混匀后测4次，取后3组数据计算平均值6设备及原理7标准100ml以下静脉注射液（无菌粉末），≥10μm微粒不多于6000个，≥25μm微粒不多于600个7-1鉴别试验（ELISA方法）ELISA（enzymelinkedimmunosorbentassay，酶联免疫吸附剂测定）指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上，进行免疫反应的定性（鉴别）和定量（活性）方法。方法分类：1双抗体夹心法2间接法3竞争法ELISA原理动画7-2鉴别试验（免疫荧光）免疫荧光技术（Immunofluorescencetechnique）基于免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。利用此技术进行组织或细胞内抗原物质的定位（鉴别）和定量（活性，如仙台CIU检测）。方法分类：1直接法（Direct）2间接法（Indirect）免疫荧光动画CIU检测荧光照片（FITC）7-3SDS-PAGESDS-PAGE（SDS：十二烷基硫酸钠，PAGE：Polyacrylamidegelelectrophoresis，聚丙烯酰胺凝胶电泳），聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式及目的：还原性和非还原性。还原性（添加强还原剂，如β巯基乙醇或DTT）是常规的SDS-PAGE，还原剂打开二硫键，SDS打开非共价键，所以使蛋白还原变性为椭圆形单体，使蛋白质1级结构的分子量大小逐渐呈梯度分开（鉴别；轻重链分析）；非还原性（不添加强还原剂）在电泳的过程中，蛋白没有完全去折叠。保持这一定的４级结构（多聚体、降解分析）。SDS-PAGE动画SDS-PAGE实例M：marker1：理化对照品2~4:3批次抗体非还原电泳图1非还原性SDS-PAGE电泳图谱M：marker1~3:3批次抗体还原电泳图2还原性SDS-PAGE电泳图谱参考：程立均等，重组单抗药物的非还原电泳纯度分析，中国生物制品学杂志，2010.01第23卷第1期P83-867-4鉴别试验（免疫印迹）免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Westernblotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。可进行蛋白进行定性和半定量分析。免疫印迹动画8水分测定《2010版药典三部》规定卡尔费休法为水分测定标准方法，分为卡氏容量法和卡氏库仑法两大方法，后者较为方便。原理：仪器的电解池中的卡氏试剂达到平衡时注入含水的样品，水参与碘、二氧化硫的氧化还原反应，在吡啶和甲醇存在的情况下，生成氢碘酸吡啶和甲基硫酸吡啶，消耗了的碘在阳极电解产生，从而使氧化还原反应不断进行，直至水分全部耗尽为止，电解产生碘是同电解时耗用的电量成正比例关系的H2O+I2+SO2+3C5H5N→2C5H5N·HI+C5H5N·SO3C5H5N·SO3+CH3OH→C5H5N·HSO4CH3SCHOTT®TitroLineKFtrace库仑法卡氏滴定仪9-1纯度（SEC-HPLC）体积排阻色谱法（SEC-HPLC）是根据分子大小进行分离的一种液相色谱技术。分子排阻色谱法的分离原理为凝胶色谱柱的分子筛机制。色谱柱多以亲水硅胶、凝胶或经修饰凝胶如葡聚糖凝胶Sephadex和聚丙烯酰胺凝胶Sepherose等为填充剂，这些填充剂表面分布着不同尺寸的孔径，药物分子进入色谱柱后，它们中的不同组分按其大小进入相应的孔径内，大小大于所有孔径的分子不能进入填充剂颗粒内部，在色谱过程中不被保留，最早被流动相洗脱至柱外，表现为保留时间较短；大小小于所有孔径的分子能自由进入填充剂表面的所有孔径，在柱子中滞留时间较长，表现为保留时间较长；其余分子则按分子大小依次被洗脱。SEC动画排阻法多聚体分析例1：引自：《2010版药典》附录VIR人免疫球蛋白单体加二聚体测定排阻法多聚体分析例2：9-2纯度（IEC-HPLC）离子交换色谱（ionexchangechromatography，IEC）以离子交换树脂作为固定相，树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆变换。固定相基团带正电荷的时候，其可交换离子为阴离子，这种离子交换剂为阴离子交换剂；固定相的带电基团带负电荷，可用来与流动相交换的离子就是阳离子，这种离子交换剂叫做阳离子交换剂。阴离子交换柱的功能团主要是－NH2，及－NH3：阳离子交换剂的功能团主要是－SO3H及－COOH。其中-NH3离子交换柱及-SO3H离子交换剂属于强离子交换剂，它们在很广泛的pH范围内都有离子交换能力；-NH2及-COOH离子交换柱属于弱离子交换剂，只有在一定的pH值范围内，才能有离子交换能力。IEC动画15-1残余宿主DNA（狭缝杂交法）供试品中的外源性DNA经变性为单链后吸附于固相膜上，在一定温度下可与相匹配的单链DNA复性而重新结合成为双链DNA，称为杂交。将特异性单链DNA探针标记后，与吸附在固相膜上的供试品单链DNA杂交，并使用与标记物相应的显示系统显示杂交结果，与已知含量的阳性DNA对照比对后，可测定供试品中外源性DNA的含量。核酸杂交动画1核酸杂交动画2