分子荧光分析方法

分子荧光分析方法制作人：杨文丽第一节概述一、分子荧光的定义及发展二、分子荧光的特点及应用三、分子荧光与紫外—可见分光光度法的异同第二节分子荧光法的基本原理一、荧光的产生二、激发光谱和荧光光谱三、荧光与物质的分子结构已经知道，荧光是在一定波长光照射下，某些分子受到激发后发出光量子所致。对一种特定的分子来说：哪些波长光使之激发产生荧光？哪个波长激发后所产生的荧光最强？——激发光谱一定波长的激发光使其产生的荧光哪个波长下最强？——荧光光谱可由实验测定物质分子的激发光谱与荧光光谱来说明。激发光谱与荧光（发射）光谱一、荧光的检测光源发出的紫外可见光通过激发单色器分出不同波长的激发光，照射到样品溶液上，激发样品产生荧光。样品发出的荧光为宽带光谱，需通过发射单色器分光后再进入检测器，检测不同发射波长下的荧光强度F。由于激发光不可能完全被吸收，可透过溶液，为了防止透射光对荧光测定的干扰，常在与激发光垂直的方向检测荧光（因荧光是向各个方向发射的）。吸收池光源检测器单色器信号显示系统单色器荧光激发光谱与荧光（发射）光谱1.激发光谱excitationspectrum：将激发荧光的光源用单色器分光，连续改变激发光波长，固定荧光发射波长，测定不同波长激发光下物质溶液发射的荧光强度(F)，作F—λ光谱图称激发光谱。从激发光谱图上可找到发生荧光强度最强的激发波长λex，选用λex可得到强度最大的荧光。二、激发光谱和荧光光谱荧光激发光谱与荧光（发射）光谱2.荧光光谱fluorescencespectrum：选择λex作激发光源，用另一单色器将物质发射（发射光谱）的荧光分光，记录每一波长下的F，作F-λ光谱图称为荧光光谱。荧光光谱中荧光强度最强的波长为λem。λex与λem一般为定量分析中所选用的最灵敏的波长。200260320380440500560620荧光激发光谱荧光发射光谱磷光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱激发光谱:固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线（图中曲线I）激发光谱形状与吸收光谱形状完全相似，经校正后二者完全相同！发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。荧光激发光谱与发射光谱的特征a.Stokes位移—荧光波长比激发光谱的波长较长在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长，称为Stokes位移。这是由于受激分子通过振动弛豫而失去转动能，也由于溶液中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量的损失。因此，在激发和发射之间产生了能量损失。b.发射光谱的形状与激发波长无关分子被激发到高于S1的电子态的更高振动能级，然而由于内转换和振动弛豫的速率很快，很快损失多余的能量而衰变到S1电子态的最低振动能级尽管分子受激到达不同能级的激发态，不管激发波长如何，电子都是从第一电子激发态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层，而与荧光体被激发至哪一个电子态无关。无论激发波长是λ1还是λ2，荧光的波长都是λ΄2激发光谱的形状与发射波长也无关20025030035040045050055060065070075080085090004008001200160020002400280032003600400044004800IFex=290nm(MAX)固定em=620nm(MAX)固定ex=290nm(MAX)em=620nm(MAX)S04321S143211→41→31→21→11→41→41→21→1c.镜像规则通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；基态上的零振动能级与第一激发态的各振动能级之间的跃迁和反跃迁几率相等200250300350400450500荧光激发光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱荧光光谱与激发光谱形状极为相似，且二者成镜像对称激光光谱与荧光光谱的应用1、定性分析将荧光物质的激发光谱和荧光光谱图的形状、位置与标准溶液的光谱图进行比较。跟紫外可见吸收光谱法相比，因参照图更多，可靠性更好。2、定量分析根据荧光光谱中最大激发波长λex和最大荧光波长λem，可得到定量分析的最佳条件。荧光与分子结构的关系分子荧光产生的必备条件分子必须能够吸收激发光分子必须具有一定的荧光量子产率)()(affII吸收的光强度荧光强度吸收的光量子数发射的光量子数ifffkkk影响因素：荧光产生过程中，辐射和无辐射过程；与每一过程的速率常数有关；kf分子结构决定（内因）；主要取决于化学结构和化学环境和结构共同决定。n振动弛豫激发n荧光（1）跃迁类型：具有电子跃迁类型的结构跃迁是产生荧光的主要跃迁类型•特点：•较大的摩尔吸光系数•较短的激发态寿命10-7~10-9s•串越至三重态几率小（2）具有大的共轭π键结构共轭度越大，荧光越强。原因：共轭体系越大，离域大π键的电子越容易激发，荧光与磷光越容易产生。化合物苯萘蒽丁省戊省λexmax(nm)205286365390580λemmax(nm)278321400480640F0.110.290.460.600.52苯萘蒽丁省戊省苯萘蒽丁省戊省（3）具在刚性平面结构0.9210.181）给电子取代剂加强荧光（4）取代基效应—HN2，—NHR，—NR2，—OH，—OR，—CN产生p→π共轭二苯甲酮：弱荧光、强磷光S1→T1的系间窜跃产率接近1化合物苯苯酚苯胺苯基氰苯甲醚λemmax(nm)278~310285~365310~405280~390285~345相对荧光强度10182020202）吸电子取代基减弱荧光、加强磷光—C=0，—COOH，—NO2不产生p→π共轭ONO2硝基苯：不产生荧光、弱磷光空间位阻对荧光发射的影响3）取代基的位置反式二苯乙烯强荧光物质NCH3H3C-O3SNCH3H3CSO3-F=0.75F=0.03CCHHCCHH立体异构体对荧光发射的影响顺式二苯乙烯非荧光物质NCH3H3C-O3SNCH3H3CSO3-CCHHNCH3H3C-O3SCCHHNCH3H3CSO3-CCHHNCH3H3C-O3S含有重原子的溶剂，由于重原子效应荧光减弱、磷光增强。（5）重原子取代基效应—Cl，—Br，—IS1→T1的系间窜跃由于重原子的存在增强思考题：一、什么是分子发光？分子发光有哪几类？二、分子荧光或磷光是如何产生的？三、什么是荧光激发光谱？什么是荧光发射光谱？各有何特点和作用？四、为什么荧光发射光谱与激发光波长无关？五、何谓Stokes位移？Stokes位移是如何产生的？六、分子产生荧光的必备条件是什么？七、分子荧光光谱仪由哪几部分组成？各部分功能如何？与UV-Vis有何不同？九、分子荧光光谱仪的激发和发射光路为何设计呈直角？谢谢观赏！小组成员：201124005杨文丽201124010张南炀201124012尹伟