荧光高分子在生物成像中的应用

荧光高分子在生物成像中的应用摘要：生物荧光成像技术在生命科学、医学及相关交叉领域具有重要应用与广阔前景。荧光材料主要分为无机纳米荧光材料、有机小分子荧光材料和有机高分子荧光材料。目前，这三类荧光材料在生物成像方面均有一定的研究与使用，比如Zn2+型探针、荧光共振能量转移（FluorescenceResonanceEnergyTransfer,FRET）探针、荧光蛋白等[1]。本文将对有机高分子荧光材料及其在生物成像中的应用进行介绍。关键词：荧光高分子生物成像生物标记直接在活体细胞内研究细胞内分子或器官的生物意义是后基因组时代的一个巨大挑战。如果可以将细胞内的分子或体内器官进行可视化，则可以直接研究其生化活动与功能。生物成像技术（BiologicalImaging）是近年来发展起来的一项分子、基因表达的分析检测系统。利用荧光探针（FluorescentProbe），对特定分子或器官进行标记，利用灵敏的检测方法，让研究人员能够直接监控活体生物体内肿瘤的生长及转移、感染性疾病发展过程、特定基因的表达等生物学过程。传统的动物实验方法需要在不同的时间点宰杀实验动物以获得数据，得到多个时间点的实验结果。相比之下，可见光体内成像通过对同一组实验对象在不同时间点进行记录，跟踪同一观察目标（标记细胞及基因）的移动及变化，所得的数据更加真实可信。因其操作极其简单、所得结果直观、灵敏度高等特点，已广泛应用于生命科学、医学研究及药物开发等方面。1荧光材料简介荧光材料主要分为三类：无机荧光纳米粒子、有机荧光小分子和有机荧光高分子。前两种均属于在实际应用中，小分子荧光化合物有一定的局限性：首先，当小分子荧光材料溶解到待测溶液中形成均相体系时，可能对待测体系产生污染，不能再作它用；第二，小分子荧光化合物溶解于考察体系后，难以提取分离，不具有重复多次的使用性；第三，一些小分子荧光化合物的非水溶性及毒副作用，限制了其在生命科学、医学等领域中的应用；第四，小分子荧光化合物难以制作光学器械，难以使其与光学仪器结合，限制了实现自动化检测。这些缺点也或多或少地影响了其作为探针在生物成像中的应用。新型荧光高分子材料是当前材料学科研究的热点。随着高分子科学的飞速发展，具有特殊光、电、磁性质的功能高分子不断被研发出来。Wolff和Pressley等于1965年便研制出了以高分子为基质的稀土荧光材料，引起了人们广泛的兴趣。随后，许多科研工作者对以高分子为基质的荧光材料及其应用进行了更为深入的研究。目前，该领域的研究工作三个方面：（1）直接采用有荧光的单体分子进行聚合；（2）将高分子溶解以后，与荧光分子（主要是无机稀土离子及其配合物）混合，然后除去溶剂；（3）在具有功能基团的聚合物侧链上面嫁接小的荧光分子，或在功能单体上面嫁接小的荧光分子，然后再进行聚合反应。相对荧光小分子而言，荧光高分子作为一种新型功能材料具有其非常优越的性能：（1）生色团以化学键结合在高分子中，不容易脱落；（2）生色团分布均匀，含量稳定，发光性能和光导性能良好；（3）应用于生物成像中，其毒副作用较小。荧光聚合物是把小分子荧光化合物引入聚合物侧链、链端或通过荧光功能单体的聚合制备的。自1960年代以来，相继已有文献报道，其研究涉及材料科学、生命科学、医学和化学等研究领域。一些具有良好机械性能、易成膜和加工方便的荧光聚合物在材料科学研究领域中受到极大关注；而一些具有良好水溶性的荧光聚合物在生命科学和医学等研究领域受到了更多的关注。[2]2荧光高分子在生物医学领域中的应用2.1荧光探针方面的应用荧光探针是利用荧光探针化合物的光物理和光化学特征，在分子水平上研究某些体系内（如细胞内）物理或化学变化过程的机理、动力学以及某种特殊环境的物理化学特征或某种材料或化合物的结构、构象及其物理化学性质的方法。赵艺强等人发明了一种用于荧光标记的高分子微球，此高分子微球具有三种尺寸：纳米级高分子微球是5-60nm，亚微米高分子微球尺寸是60nm-1μm，微米级高分子微球是1μm-20μm，在上述高分子微球上吸附或者化学键合有荧光染料分子或荧光探针分子，该类高分子微球可用于生物分子研究中的荧光探针，实现了荧光信号的可控放大。[3]Wu等合成的带有碳酰肼识别基团的水溶性聚合物与DNA有较好的相互作用，在DNA荧光探针方面具有潜在的应用价值。[4]Wang等圈用单链DNA和平面的有机荧光团合成了可折叠的带有DNA序列的荧光聚合物，如下图1。当聚合物与含有不匹配碱基对的聚核苷酸结合时，荧光光谱的变化反映出聚核苷酸构象的变化，该荧光聚合物可作为DNA荧光探针。[5]图1带有DNA序列的荧光聚合物2.2组织工程和生物成像方面的应用新开发的人造荧光聚合物有可能让科学家监测培养的组织的生长情况。尽管荧光染色和量子点被广泛用于组织工程和生物成像研究，但它们的毒性造成很难长期在活组织中使用这些试剂。YangJian等开发了一类新型可降解生物荧光聚合物BPLP-Ser，它是一种可应用于组织工程、药物释放和生物成像的支架材料。研究者通过在一个化学反应中引入一个氨基酸和柠檬酸，从而改变了此前聚合物的合成工艺。实验结果表明，当这种氨基酸的关键原子与聚合物的骨架结合时，形成了一个环状结构——即产生荧光的关键。研究者提出，氨基酸的选择影响了荧光强度和波长。这种荧光聚合物可以进入细胞膜，其对于成纤维细胞无毒，而且小鼠在5个月的时间里只在其体内导致了轻微的炎症。下图为该聚合物纳米颗粒和多孔骨架植入小鼠体内之后的荧光图。[6]图2BPLP-Ser纳米颗粒植入小鼠体内图3BPLP-Ser多孔骨架植入小鼠体内Kai等人采用经过改良的溶剂萃取/蒸发技术在PLGA纳米粒子中负载有机可溶的共轭聚合物（ConjugatedPolymer,CP），制备出一种在水溶液中能稳定存在、生物相容性高、具有可功能化表面、荧光强度高的荧光高分子颗粒。同时，通过改变共轭聚合物的种类（如图4），也可调节产物粒子的荧光性能。用研究其生物成像功能，如图5所示，激光共聚焦扫描显微镜研究表明产物粒子CPLNPs富集在细胞核周围的细胞质中，具有很强的荧光效应。在与叶酸共轭，进行表面功能化之后，产物粒子的在MCF-7乳腺癌细胞内的摄取量得到了显著地提高，说明了改性后的粒子在细胞成像中具有选择性靶向作用。这种CPLNPs具有低毒性、高荧光强度、高耐光性、表面可功能化等优点，为特定的生物成像和检测的探针的研究提供了一个新的方向和领域。[7]图4几种不同的共轭聚合物图5CPLNPs在MCF-7乳腺癌细胞中的荧光成像2.3荧光蛋白最早出现的绿色荧光蛋白（GreenFluorescentProtein,GFP）是由下村修等人在1962年在一种学名AequoreaVictoria的水母中发现，它是由238个氨基酸组成的单体蛋白质，其荧光的产生主要是在氧气存在下，分子内第67位的甘氨酸的酰胺对第65位丝氨酸的羧基的亲核攻击形成第5位碳原子咪唑基，第66位酪氨酸的α-2β键脱氢反应之后，导致芳香团与咪唑基结合，这样GFP分子中就形成对羧基苯甲酸唑环酮生色团发出荧光。在搞清楚了这一原理后，GFP被广泛的应用到生物学研究中了，各个厂家如Promega公司、Stratagene公司（包括来自香港中文大学的橙色蛋白制备技术）、Clontech公司（现属Takara公司）等都出产了相应的产品。荧光蛋白在某种定义下可以说是革新了生物学研究——运用荧光蛋白可以观测到细胞的活动，可以标记表达蛋白，可以进行深入的蛋白质组学实验等等。特别是在癌症研究的过程中，由于荧光蛋白的出现使得科学家们能够观测到肿瘤细胞的具体活动，比如肿瘤细胞的成长、入侵、转移和新生。但此前穿透性最强的荧光蛋白质也不能帮助研究者看到活体生物体皮下更深层的状况。随着俄罗斯科学院的DmitriyChudakov最近培育出穿透性极强、能用于全身标记成像的深红色荧光蛋白质Katushka[8]，此成果发布在NatureMethods上，也标志着利用荧光蛋白质进行的生物研究领域出现重大突破。图6深红色荧光蛋白质Katushka的全身标记效果图（与另一种荧光蛋白DsRed-Express比较）3总结与展望目前，由于其高荧光强度、生物毒性较低等特性，荧光高分子材料在生物成像方面已经得到了广泛的研究与应用。无论是通过化学方法合成出的高分子颗粒，还是对天然荧光蛋白进行改性，得到的荧光高分子均能制成效果优良的荧光探针。再配上日益精湛的检测技术，荧光高分子材料的生物成像也是一种具有广泛应用前景的技术。参考文献[1]KazuyaKikuchi.Design,synthesisandbiologicalapplicationofchemicalprobesforbio-imaging[J].Chem.Soc.Rev.,2010,39:2048–2053.[2]刘云霞.可降解生物荧光高分子-半导体量子点荧光复合材料及稀土荧光纳米晶的可控制备、结构与形貌调控及性质研究[D].呼和浩特:内蒙古大学,2012.[3]赵艺强,高海峰,杨武利等.荧光标记的高分子微球及其制备方法[P].中国:00116548.8,2001.[4]Z.Q.Wu,S.L.Gong,C.Li,etal.NovelWater-SolubleFluorescentPolymerContainingRecognitionUnits:SynthesisandInteractionswithPC12Cell[J].Eur.Polym.J.,2005,41(9):1985-1992.[5]W.Wang,W.Wan,A.Stachiw,etal.FoldamerswithHybridBiologicalandSyntheticSequencesasSelectiveDNAFluorescentProbes[J].Biochemistry,2005,44(32):10751-10756.[6]J.Yang,Y.Zhang,S.Gautam,etal.DevelopmentofAliphaticBiodegradablePhotoluminescentPolymers[J].PNAS,2009,106(25):10086-10091.[7]K.Li,J.Pan,S.S.Feng,etal.GenericStrategyofPreparingFluorescentConjugated-Polymer-LoadedPoly(DL-lactide-co-Glycolide)NanoparticlesforTargetedCellImaging[J].Adv.Funct.Mater.,2009,19:3535–3542.[8]DmitryShcherbo,EkaterinaMMerzlyak,TatianaVChepurnykh,etal.Brightfar-redfluorescentproteinforwhole-bodyimaging[J].NatureMethods,2007,4(9):741-746.