食品中菌落总数的检测方法-曹勇

食品微生物学菌落总数的检测GB4789.2-2016一、菌落总数的定义※GB标准：食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g(mL)检样中形成的微生物菌落总数。※菌落总数不是指细菌总数！二、检验程序检样25g（mL）+225mL稀释液，均质10倍梯度稀释倾注平板计数琼脂（PCA）15-20ml计数和报告选取2-3个适宜稀释度的样品稀释液各1mL，加入无菌平皿中培养36℃±1,48h±2h三、操作步骤1.样品的处理，1.1、固体和半固体样品：称取25g样品置盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，8000r/min—10000r/min均质1min-2min,或放入盛有225ml稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min-2min,制成1:10的样品均液。1.2、液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品置盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。操作步骤1.3、用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用一支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1：100的样品匀液1.4按1.3操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用一次1mL无菌吸管或吸头。1.5根据对样品污染状况的估计，选择2-3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液）,每个稀释度分别吸取1mL加入两个无菌平皿内。同时分别取1mL稀释液加入两个无菌平皿作空白对照。1.6及时将15mL-20mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。四、培养2.1琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±1℃培养48h±2h。水产品30℃±1℃培养72h±3h.2.2如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4mL)，凝固后翻转平板，按2.1条件进行培养。五、菌落计数3.1可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-formingunits,CFU）表示。3.2选取菌落数在30CFU~300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。菌落计数3.3其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。3.4当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。六、结果报告1菌落总数的计算方法1.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克（或毫升）中菌落总数结果。1.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式（1）计算：N=∑C/（n1+0.1n2）d……………………（1）N―样品中菌落数；∑C―平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；n1―第一个适宜稀释度平板个数；n2―第二个适宜稀释度平板个数；d―稀释因子（第一稀释度）。结果报告1.3若所有稀释度的平板上菌落数均大于300，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。1.4若所有稀释度的平板菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。1.5若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。1.6若所有稀释度的平板菌落数均不在30-300之间，其中一部分小于30或大于300时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数计算。结果与报告2.1菌落数在100以内时，按“四舍五人”原则修约，以整数报告。2.2大于或等于100时，第三位数字采用“四舍五人”原则修约后，取前两位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五人”原则修约后，采用两位有效数字。2.3若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。2.4若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。2.5称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。七、菌落总数的计算方法菌落总数的计算方法八、注意事项1、平板计数琼脂不凝固：放置于46±1℃恒温水浴箱中保温（≤4h），使用时摇匀一下。由于琼脂比重大，容易沉在瓶底部。2、出现蔓延菌落:可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4mL），凝固后翻转平板。3、必须做空白对照：如果空白对照试验，空白无菌落生长符合要求。4.培养条件：一般样品36℃±1℃/48h±2h，水产品（指原生态、未加工水产品）30℃±1℃/72h±3h.5.平板计数琼脂温度不要过高：温度高容易烧死平板里的细菌，使菌落总数减少。温度低琼脂容易凝固。食品中菌落总数3M测试片法的检测使用SN/T1897-2007行业标准SN0168-1992出口标准一、3M菌落总数测试片的原理细菌总数测试片是一种预先制备好的培养基系统，含有标准的培养基，冷水可溶性的凝胶剂和三苯四氮唑（TTC)指示剂，菌落在测试片上呈现红色或粉红色菌落，这样可增加菌落计数效果。二、接种操作图示1.将测试片置于平坦处，揭开上层膜2.垂直滴加1mL样液于测试片中央接种操作图示4.使用压板的凹面使样液均匀分布在圆形接种区域内，静置至少1min使胶凝固3.允许上层膜直接落下，但勿滚动上层膜三、培养将测试片的透明面朝上置于培养箱内，可堆叠至20片，培养温度和时间为36C1C,48h2h。四、菌落的判读计数所有红点菌落的判读菌落密度很高时，整个测试片会变成红色或粉红色，将结果记为“多不可计”圆形培养基的边缘有许多小的菌落，也记为“多不可计”五、菌落的估算浅粉红色菌落菌落的估算六、菌落蔓延的读数七、3M菌落测试片计数1.计数范围，培养后，立即计数每个平板上的菌落数。25-250个菌落为合适范围，如果不能立即计数，应将平板存放于-15℃，但不得超过7d.2.计算方法有些不同，见标准SN0168-92出口食品平板计数。七、3M菌落测试片的注意事项1.稀释度的选择，一定要选择合适的稀释度进行样品的检测。2.防止菌落蔓延现象。①24小时判读；②减少叠放；③使用较大的压板；④提高稀释度。3.做空白试验。4.测试片压板以外的菌落不计数。八、陆桥测试片操作要点1、掀开上层透明膜2、取1mL样液缓缓加入纤维垫上陆桥测试片操作要点3、5s后，待样液完全吸收4、缓缓将透明膜盖回陆桥测试片操作要点5、接种完成，正置培养九、陆桥测试片培养判读1.培养条件：36±1℃/48±2h2.菌落颜色：红色陆桥测试片判读及计数同国标GB4789.2-2010一样。十、陆桥测试片的注意事项1.样品制备按国标要求进行，选择合适稀释度即可。2.整个操作需要在无菌条件下进行。3.加入样品后薄膜轻轻放下即可，不要压盖无纺布部分，可压紧边缘薄膜。4.若薄膜放下时产生与空气连通的褶皱，则重新揭开薄膜，再次盖上。保证无连通空气的褶皱出现。5.做空白试验。结束语