第十四章-溶菌酶

第十四章溶菌酶食品的防腐保鲜始终是食品领域一个亟待解决的重要问题微生物是导致食品腐烂变质的罪魁祸首最有效的解决办法——添加食品防腐剂目前使用最多的——化学防腐剂天然食品防腐剂——溶菌酶的研发成为热点问题的提出[EC.3.2.1.17]，系统名为：N-乙酰胞壁质聚糖水解酶简称胞壁质酶溶菌酶的研究最早是从尼科尔(Nicoile)1907年发表枯草杆菌溶解因子的报告开始的。两年后，Laschtschenko指出：鸡卵白强烈抑菌作用是酶作用的结果。1922年英国细菌学家A.Fleming发现人的唾液、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶，因其具有溶菌作用，故命名为溶菌酶。Lysozyme（LZM）一、溶菌酶的来源于分布广泛存在于人体多种组织中，鸟类和家禽的蛋清；哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁等体液；微生物；以蛋清含量最为丰富。溶菌酶的含量比较来源不同的溶菌酶，活性不同。其中，以人溶菌酶的活性最高，分别是蛋清溶菌酶的3倍，牛乳溶菌酶的3000倍（K.J.Losnedahl，1998）。鸡蛋清3mg/ml人乳0.1-0.5mg/ml人眼泪牛乳无花果7mg/ml0.13mg/ml1.0-1.1mg/g蛋清，植物，微生物发酵二、性质及作用机理性质：溶菌酶纯品为白色或微黄、黄色的结晶体或无定型粉末；无异味，微甜；易溶于水；遇碱易被破坏；在酸性pH下稳定，此时100℃的加热对溶菌酶仅有很小的活性损；，不溶于乙醚。抗菌机理细菌的细胞壁由胞壁质组成，胞壁质是由N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamineNAG)及N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramicacidNAM)交替组成的多聚物，胞壁酸残基上可以连接多肽，称为肽聚糖(Peptidoycan)。肽聚糖是由NAM、NAG和肽“尾”(一般是4个氨基酸)组成，NAM与NAG通过β-l，4糖苷键相连，肽“尾”则是通过D-乳酰羧基连在NAM的第3位碳原子上，肽尾之间通过肽“桥”(肽键或少数几个氨基酸)连接，NAM、NAG、肽“尾”与肽“桥”共同组成了肽聚糖的多层网状结构，作为细胞壁的骨架。溶菌酶的功能图示肽链中Glu35和Asp52所构成的活性中心LZM专一地作用于细菌细胞壁肽多糖分子中NAM与NAG之间的β-1,4键，从而催化细菌细胞壁中的肽多糖水解，破坏细菌的细胞壁，使细菌溶解死亡溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。对于G+细菌与G-细菌，其细胞壁中肽聚糖含量不同，G+细菌细胞壁几乎全部由肽聚糖组成，而G-细菌只有内壁层为肽聚糖，因此，溶菌酶只能破坏G+细菌的细胞壁，而对G-细菌作用不大。三、溶菌酶的种类根据来源不同，将溶菌酶分为四类动物源溶菌酶：鸡蛋清溶菌酶、人和哺乳动物溶菌酶植物源溶菌酶微生物源溶菌酶噬菌体源溶菌酶常见的几种溶菌酶1、蛋清溶菌酶---保鲜中应用最多鸡蛋清溶菌酶占蛋清总蛋白的3.4%～3.5%，作为溶菌酶类典型代表，是目前重点研究对象，也是了解最清楚溶菌酶之一。从鸡蛋清中提取分离的溶菌酶是由18种129个氨基酸残基构成的单一肽链。它富含碱性氨基酸，有4对二硫键维持酶构型，是一种碱性蛋白质，其N端为赖氨酸，C端为亮氨酸。四条多肽链组成。相对分子量14000等电点为10.8最适温度为50℃，最适pH值为6～7。化学性质非常稳定，在pH1.2～11.3范围内剧烈变化时，结构仍稳定不变。遇热也很稳定，在pH4～7、100℃处理1min不失活，是一种稳定的碱性蛋白质，但在碱性条件下对热稳定性较差。分解G+细菌，但对G-细菌不起作用其它鸟类如鹌鹑、珍珠鸡、火鸡等的蛋清中也分离纯化出溶菌酶；与鸡蛋清溶菌酶活性非常相似，也由129个氨基酸组成，虽排列顺序有所不同，活性部位也不相同，但活性部位的氨基酸排列则大体相同。2、人及哺乳动物溶菌酶人溶菌酶存在于眼泪、唾液、鼻粘液、乳汁等分泌液以及淋巴腺、白血球、肝、肾、淋巴组织中，1ml眼泪中含7mg溶菌酶，1ml乳汁中含0.1～0.5mg。人溶菌酶由130个氨基酸残基组成，有4个S-S键，分子量为14600，其溶菌活性比鸡蛋清溶菌酶高2倍。对于哺乳动物溶菌酶，目前已从牛、猪、猫、兔、猴、马、羊等动物的乳汁中分离出溶菌酶，其化学性质与人溶菌酶相似，但结构尚不清楚，其溶菌活性也远低于人溶菌酶约3000倍。曾林（1999）采用琼脂平板法测定家兔初乳溶菌酶含量。结果表明：初乳溶菌酶含量为（7.96±2.01）μg/ml，常乳溶菌酶含量(5.01±1.32)μg/ml。人及哺乳动物溶菌酶的作用机制与鸡蛋清溶菌酶相同。3、植物溶菌酶目前已从木瓜、无花果、芜菁、大麦等植物中分离出溶菌酶，其分子量较大，约为24000~29000。植物溶菌酶对溶壁小球菌的溶菌活性不超过鸡蛋清溶菌酶的1/3，但对胶体状甲壳质的分解活性则是鸡蛋清溶菌酶的10倍。周泽文（1994）从菜心分离溶菌酶表明，酶比活力达3414.6U/mg，纯化倍数为197.4。菜心溶菌酶在较宽的温度和pH植范围内均有活性，最适温度为60℃，最适pH值为5.8。高向阳（1997）研究了萝卜溶菌酶对白色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆3种革兰氏阳性菌和变形菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏杆菌、多杀巴斯德氏杆菌、雏白痢沙门氏菌、产气杆菌6种革兰氏阴性菌及酿酒酵母、总状毛霉、黑根霉、黑曲霉、青霉5种真菌的抑菌效果。同时还研究了萝卜溶菌酶对白菜软腐病菌、柑橘溃疡病菌、番茄青枯病菌、水稻细条病菌、水稻白叶枯病菌及烟草青枯病菌6种植物病原细菌的抑菌效果。试验证明：萝卜溶菌酶对上述参试的菌种都有不同程度的抑菌作用。4、微生物产生的溶菌酶根据其作用对象分为两类：细菌细胞壁溶菌酶真菌细胞壁溶菌酶细菌细胞壁溶菌酶可分为三大类：N-乙酰氨基己糖苷酶：破坏细菌细胞壁肽聚糖中β-(1，4)糖苷键酰胺酶：催化裂解细菌细胞壁肽聚糖中N-乙酰胞壁酸与肽“尾”之间的N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸键内肽：催化裂解肽聚糖肽桥中的肽键现在研究发现，细菌细胞壁溶菌酶的抗菌活性不仅表现在其分解细菌细胞壁方面，当酶受到不可逆抑制后，它仍然显示出抗菌效应；不同来源的细菌细胞壁溶菌酶有不同的抗菌范围，并对不同类型的肽聚糖有特异性。真菌细胞壁溶菌酶：几丁质酶和β-葡聚糖酶几丁质酶几丁质酶主要用于真菌细胞壁的降解和重组，但大多数产几丁质酶的真菌中，主要用于真菌细胞壁的成型过程，由于肽聚糖和甲壳质的糖骨架具有相似的结构，一些几丁质酶也具有溶菌酶活性β-葡聚糖酶β-葡聚糖酶主要用于分解酵母细胞的细胞壁。如β-(1，3)葡聚糖酶主要作用是它能水解β-(1，3)糖苷键，还可以对几丁质降解真菌细胞壁起到显著的协同作用将纯化的几丁质酶和β-葡聚糖酶合用，其抗灰色葡萄孢(Botrytiscinera)作用能够提高10倍5、噬菌体产生的溶菌酶一种特异性的酶，由噬菌体感染、诱导产生，但未被感染的宿主细胞上不存在该酶。四、溶菌酶的应用过程中体现的优点（1）溶菌酶是很稳定的蛋白质，有较强的抗热性。蛋清溶菌酶是已知的最耐热的酶；（2）溶菌酶不会因为有机溶剂的处理而失活，当转移到水溶液中时，溶菌酶的活力可全部恢复；（3）溶菌酶可被冷冻或干燥处理，且活力稳定；（4）溶菌酶适宜pH5.3~6.4，可用于低酸性食品防腐；（5）溶菌酶生产成本较低；（6）溶菌酶的抗菌谱较广，不仅局限于G+菌，对部分G-菌也有抑制效果；（7）溶菌酶作为防腐剂安全性高。溶菌酶是一种天然蛋白质，1992年FAO/WTO的食品添加剂协会已经认定溶菌酶在食品中应用是安全的。五、溶菌酶的应用溶解微生物细胞壁，对人体细胞无影响。广泛应用医药、食品的灭菌领域。消除炎症，清除坏死组织等。食品的防腐保鲜---非加热的方法。（1）干酪保鲜在干酪生产中添加一定量的溶菌酶，可以防止微生物污染引起的酪酸发酵，保证干酪的质量。（2）水产品保鲜鱼虾等，易腐变质。冷冻或盐腌的方法保鲜，但设备要求高，或者盐腌风味改变。把一定浓度的溶菌酶喷洒在水产品上，起到防腐保鲜的作用。（3）低浓度酿造酒的保鲜酿造酒的酒精含量低，微生物可以生长，引起变质。如清酒酒精含量15~17%，大多数微生物不能生长，但乳酸菌---火落菌，可以生长产生不良风味。水杨酸作为防腐剂，但过多会损害人的胃和肝脏。加入15mg/kg的溶菌酶，起到防腐作用（4）乳制品的保鲜与强化Freshmilk含有13mg/mlHumanmilk含有40mg/ml强化溶菌酶，防腐保鲜，人乳化作用。（5）其他食品保鲜香肠奶油保鲜（生）面条奶油蛋糕是容易腐败变质的食品之一，在糕点中加入溶菌酶，可防止微生物的繁殖，起到防腐作用。章银良研究了溶菌酶对草莓的保鲜作用，发现将溶菌酶与甘氨酸联用，保鲜效果更佳。由于处于酵母细胞壁中的蛋白质利用率很低，所以利用溶菌酶破坏酵母细胞壁，可制成微生物蛋白质，提高酵母蛋白质的利用率。用含放线菌体的溶菌酶处理酵母液可生产出含有5'-肌苷酸、5'-鸟苷酸及其他呈味物质。将溶菌酶固定化在食品包装材料上，生产有抗菌功效的食品包装材料，以达到抗菌保鲜功能。目前许多肉制品软包装都需要经过高温灭菌处理。经过处理的肉制品脆性变差甚至产生蒸煮味。如果在产品真空包装前添加一定量溶菌酶(1%～3%)，然后巴氏杀菌(80～100℃，25～30min)，可获得很好的保鲜效果。（6）在食品包装工业中的应用溶菌酶是一种无毒、无害的高盐基蛋白质，且具有一定的保健作用，有抗感染和增强抗生素作用效力，促进血液凝固及止血作用，有组织再生作用。因此，可以在保健食品中添加一定量以提高保健效果。（7）在功能性食品中的应用注意酶的专一性：对于酵母、霉菌、G-引起的腐败变质效果不理想。酶的稳定性与有效期。医学上应用一种具有杀菌作用的天然抗感染物质。有抗菌、抗病毒、止血、消肿止痛及加快组织恢复功能等作用。临床用于慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、口腔溃疡、水痘、带状疱疹和扁平疣等。也可与抗菌药物合用治疗各种细菌和病毒感染。口服和肌注均有效。口服，3～5片/次(肠溶片含10mg)，3次/日。口含，1片/次(口含片含20mg)，4～6次/日。外用：以1%～2%溶液滴注、涂擦或直接喷粉。肌注，50mg～100mg/次，1～2次/日。滴眼：用2%溶液。副作用偶有较轻的过敏反应。氯化溶菌酶医疗效果更广，有浓痰分散、出血抑制、组织修复、消炎镇痛、抗过滤性病毒等作用；用氯化溶菌酶的制药有消炎消痔、治感冒、皮肤病及眼、鼻、喉等用药.七、溶菌酶的市场行情溶菌酶是当前在国内外非常紧俏的一种生化产品目前在我国黑龙江、辽宁、天津、北京、河北、河南、山西、山东、湖南、湖北、浙江、江苏等地均有蛋清溶菌酶生产。但大多数企业的生产能力有限，产品质量难以保证，生物活性较低（1,700-5,000u/mg），价格也低廉（2,000-4,000元/公斤）。国内溶菌酶防腐剂产品较少，而日本Q.P.公司于2000年就将其注册产品LYSOPOWDERP-2推向了市场。溶菌酶制剂白色晶体。碱性蛋白质，等电点PH10.5~11.0。溶菌酶产品活力≥2.0万u/mg。溶于稀盐水，在丙酮和乙醇作用下生成沉淀。酸性溶液比较稳定，加热至55℃也不会受到影响，其水溶液在62.5℃，30分钟会完全失活，而15%乙醇溶液在62.5℃，60分钟，20.5%乙醇溶液在62.5℃，20分钟也不失活。使用条件：最适温度35℃，pH4—6.5参考用量：0.07~0.1%保存条件：防潮避光、阴凉处密封保存；避免与氧化剂接触，不宜与金属长时间接触。保质期一年。本章重点1、简述溶菌酶的抗菌机理。2、溶菌酶的种类3、举例说明溶菌酶的应用。TheEnd