傣药决明子中一个新的倍半萜类化合物及其细胞毒活性-2019年精选文档

傣药决明子中一个新的倍半萜类化合物及其细胞毒活性[]Forthepurposeoffindingnewbioactiveagentsfromethnicmedicines，thechemicalstudyonDaiMedicineCassiaoccidentaliswascarriedout.ThechemicalconstituentsfromtheseedsofC.occidentaliswereisolatedbycolumnchromatographicmethodsonsilicagel，MCI-Gelresin，SephadexLH-20，andhighperformanceliquidchromatography.Theirstructureswereelucidatedbyspectroscopicmethods，includingextensive1Dand2DNMRtechniques.ThecytotoxicityofthecompoundforNB4，A549，SHSY5Y，PC3，andMCF7cellslinewasalsoassayedbyusingtheMTTmethod.Twosesquiterpenes（1and2）wereisolatedfromthisplant.Compound1isanewcompoundandnamedasmethyl6-（hydroxymethyl）-4-isopropyl-7-methoxynaphthalene-1-carboxylate.Compound1alsodisplayedhighcytotoxicitywiththetestedcancercell-lines.doi：10.4268/cjcmm20161722决明子CassiaeSemen，别名马蹄决明、决明、草决明，是豆科植物决明或小决明的干燥成熟种子，因其有明目之功而名之[1]。决明子是我国历史悠久的药用植物，最早《神农本草经》将决明子列为上品，称之“能治诸眼疾，久眼益精光，轻身”。在我国主要分布在安徽、广西、四川、浙江、广东、云南等地，为一年生亚灌木状草本植物[2-3]。决明子为我国傣族民间常用的中草药，其味苦、甘、咸，性微寒，入肝、肾、大肠经；具有润肠通便，清肝明目，降血压降血脂的功效，多用于治疗便秘，高血脂、高血压，头痛眩晕，目暗不明[2-4]。目前国内外学者对决明子进行过一些研究，主要报道的化学成分有蒽醌、甾体、黄酮、萜类等类型的化合物[2-7]。为充分利用我国丰富的资源，进一步寻找新的活性天然产物，本文对产于西双版纳的决明子化学成分进行了研究，并从中分离到2个倍半萜类化合物（1和2），其中化合物1为新化合物，并且该化合物具有细胞毒活性。1材料UV-2401A紫外光谱仪（日本岛津公司）；Bio-RadFTS-185傅里叶变换红外光谱仪（美国伯乐BIO-RAD公司）；DRX-500型核磁共振仪（瑞士布鲁克公司）；1200型半制备高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），色谱柱为安捷伦公司ZorbaxPrepHTGF（21.2mm×250mm，7μm）制备柱，酶联免疫检测仪（上海圣科仪器设备XX公司），96孔细胞培养板（美国康宁公司），移液枪（德国埃彭多夫公司），CO2培养箱（艺斯高上海贸易XX公司），BS-ⅡFA恒温摇床（常州市开元实验仪器XX公司）。拌样时使用80～100目硅胶，柱色谱使用200～300目硅胶，GF254（100mm×100mm）硅胶板，均为青岛海洋化工厂生产；MCI填充材料为MCI-gelCHP-20P（75～150μm），日本三棱株式会社生产；葡聚糖凝胶为SephadexLH-20，美国通用电气公司生产；G薄层色谱硅胶板，青岛海洋化工厂生产，显色剂为5%H2SO4乙醇溶液，喷洒后适当加热即可；工业用三氯甲烷、丙酮、甲醇、乙酸乙酯、石油醚；色谱纯乙腈、四氢呋喃（昆明旺蓓经贸XX公司）；超纯水（用美国Millipore公司Milli-Q50超纯水仪处理，电阻18MΩ?cm-1）；5种人源癌细胞株：急性早幼粒细胞白血病细胞（NB4）、人肺腺癌细胞（A549）、人神经母细胞瘤细胞（SHSY5Y）、人前列腺癌细胞（PC3）和人乳腺癌细胞（MCF7），所有肿瘤细胞均购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）；1640（无血清）培养基（武汉维诺赛生物技术XX公司）；MTT试剂盒（碧云天生物技术XX公司）；二甲基亚砜（德国默克公司）。决明子于2014年8月购自云南西双版纳傣医院，产地为云南西双版纳洲勐腊县，经西双版纳傣医院林艳芳医师鉴定为豆科决明属植物决明子。2提取分离取1.5kg晒干的决明子，粉碎到30目，然后用95%乙醇提取4次，每次用量为3.0L，室温浸泡、超声4次（每次30min），经过滤后减压浓缩除去乙醇，再加2L水进行稀释，用乙酸乙酯萃取3次（每次用乙酸乙酯2L），乙酸乙酯相减压浓缩得浸膏41.2g。浸膏用60g（80～100目）粗硅胶拌样，烘干，用280g硅胶（150～200目）柱色谱分离，三氯甲烷-丙酮（9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，1∶2）梯度洗脱，分成6个部分。将8∶2洗脱部分（8.3g）经MCI脱色，以CH2Cl2-CH3OH（50∶1，25∶1，10∶1，5∶1）梯度洗脱分成4个部分，取25∶1部分（1.2g）进行HPLC进一步分离，采用Agilent公司的ZorbaxPrepHTGF（21.2mm×250mm，7μm）反相柱，以50%甲醇水溶液为流动相，流速为20mL?min-1，收集36.6min的色谱峰可得化合物1粗品，收集26.4min的色谱峰可得化合物2粗品。粗品用纯甲醇溶解，以纯甲醇为流动相用，用SephadexLH-20葡聚糖凝胶柱净化，可得化合物1（14.6mg）和化合物2（11.8mg）（图1）。3结构鉴定化合物1浅黄色胶状物；UVλ（nm）：210（4.20），238（3.67），332（3.83）；IRν（cm-1）：3416，3060，2958，1708，1650，1610，1563，1460，1349，1255，1238，1150，921，835；ESI-MSm/z311[M+Na]+；HR-ESI-MSm/z311.1253[M+Na]+（计算值311.1259，C17H20O4Na）。结合1H和13C-NMR谱确定分子式为C17H20O4，不饱和度为8。红外光谱数据证实化合物中存在羰基（1708，1650cm-1）和芳环（1610，1563，1460cm-1）功能团，紫外光谱在332和238nm处有强吸收也证实化合物中存在芳环结构。从1H和13C-NMR谱（表1）信号可以看出化合物中有1个1，4，6，7-四取代的萘环信号[δc125.2（C-1），130.9（C-2），120.0（C-3），148.5（C-4），125.8（C-5），145.1（C-6），156.9（C-7），106.4（C-8），132.0（C-9），128.4（C-10）；δH8.09（1H，d，J=8.2Hz，H-2），7.03（1H，d，J=8.2Hz，H-3），7.79（1H，s，H-5），8.36（1H，s，H-8）]，1个异丙基信号[δc31.9（C-11），23.5（C-12），23.5（C-13）；δH3.38（1H，m，H-11），1.35（3H，d，J=6.8Hz，H-12），1.35（3H，d，J=6.8Hz，H-13）]，1个甲酸酯基信号[δc168.3（C-14），52.5（-OMe-14）]，1个羟甲基信号[δc58.3（C-15）；δH4.70（2H，s，H2-15）]，1个甲氧基信号[δc56.1（-OMe-7）]；这些信号表明化合物可能为芳构化的倍半萜类化合物[8]。化合物的母核得到确认后，剩余的羟甲基、异丙基和甲氧基为母核上的取代基。根据H-11（δH3.38）和C-3（δc120.0）、C-4（δc148.5）、C-10（δc128.4），H-12（δH1.35）、H-13（δH1.35）和C-4（δc148.5），以及H-3（δH7.03）和C-11（δc31.9）的HMBC（图2）相关可证实异丙基取代在萘环的C-4位；根据H2-15（δH4.70）和C-5（δc125.8）、C-6（δc145.1）、C-7（δc156.9）的HMBC相关，可证实羟甲基取代在母核的C-6位；根据甲氧基氢（δH3.83s）和C-7（δc156.9）有HMBC相关，可证实甲氧基分别取代在母核的C-7位；根据H-8（δH8.36）和C-1（δc125.2），H-2（δH8.09）和酯羰基C-14（δc168.3）有HMBC相关，以及H-3（δH7.03）和酯羰基C-14（δc168.3）没有HMBC相关，可推测酯羰基取代在母核的C-1位。至此本化合物的结构得以确定，该化合物命名为6-羟甲基-4-异丙基-7-甲氧基-1-萘甲酸甲酯。化合物2黄色胶状物；1H-NMR（C5D5N，500MHz）δ：5.94（1H，s，H-3），7.36（1H，s，H-5），7.08（1H，s，H-8），3.32（1H，m，H-11），1.15（3H，d，J=7.2Hz，H-12），1.18（3H，d，J=7.2Hz，H-13），1.31（3H，s，H-14），2.19（3H，s，H-15）；13C-NMR（C5D5N，125MHz）δ：73.5（s，C-1），199.6（s，C-2），118.0（d，C-3），161.4（s，C-4），128.9（d，C-5），124（s，C-6），156.9（s，C-7），113.0（d，C-8），120.2（s，C-9），141.8（s，C-10），33.6（d，C-11），22.3（q，C-12），21.9（q，C-13），28.9（q，C-14），16.2（q，C-15）。以上数据与文献[8]报道的化合物（1S）-1-methoxylacinileneC对比，鉴定为lacinileneC。4细胞毒活性对化合物1进行了细胞毒活性筛选。细胞毒活性检测参照文献[9]采用改良的MTT测定法，以紫杉醇为阳性对照药，采用了5种人源癌细胞株：急性早幼粒细胞白血病细胞（NB4）、人肺腺癌细胞（A549）、人神经母细胞瘤细胞（SHSY5Y）、人前列腺癌细胞（PC3）和人乳腺癌细胞（MCF7），所有肿瘤细胞均购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。具体实验步骤如下：收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100μL，铺板使待测细胞密度调为1万/孔。在5%CO2，37℃的条件下孵育至细胞贴壁，加入浓度梯度的药物（设0，0.2，1，2.5，5，10μmol?L-16个浓度梯度，每孔100μL），继续在5%CO2，37℃条件下孵育24～72h，倒置显微镜下观察。再往每孔加入20μLMTT溶液（5g?L-1，即0.5%MTT），继续培养4h后终止培养，小心吸去孔内培养液，接着每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测A490nm处测量各孔的吸光值。计算药物对细胞生长的抑制率。同时设置空白组（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。通过测定药物在不同浓度下对细胞的抑制率；抑制率=（空白对照A-加药孔的A）/空白对照A×100%；并采用改良寇式法计算IC50。每个化合物平行测定3次，结果取平均值，测定结果为：紫杉醇的IC50分别为：0.03，0.02，0.05，0.05，0.03μmol?L-1，化合物1的IC50分别为（2.1±0.2），（2.8±0.3），（3.6±0.4），（2.9±0.2），（3.4±0.3）μmol?L-1，结果表明化合物1对所测试的人源肿瘤细胞增殖具有细胞毒活性。[[]Forthepurposeoffindingnewbioactiveagentsfromethnicmedicines，thechemi