PCR引物设计方法和原理

PCR引物设计方法和原理一、引物设计的目的•获得目标片段•DNA测序•基因克隆•体外转录•突变•探针设计•分子标记二、引物设计的类型•常规PCR引物•PCR同源引物和简并引物•探针引物设计的步骤•下载DNA模板或蛋白质序列•进行同源比较，找到保守同源序列•设计引物四、PCR引物设计的原则•引物长度（primerlength）:18-27bp•GC钳(GCclamp}:引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加•3’末端碱基（3’EndSequence）:ＧＣＴ•Tm值(meltingtemperature)：52~60℃•GC含量（composition）：40-60%四、PCR引物设计的原则•∆G值是指DNA双链形成所需的自由能(internalstability,用∆G值反映):选用3’端∆G值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间∆G值相对较高的引物•引物二聚体(primerdimer)及发夹结构（duplexformationandhairpin）的能值:超过4.5kcal/mol易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行•引物的修饰:一般是在5’端增加酶切位点Breslauer,邻近法的相邻核苷酸的动力学数值(自由能)来预测双链稳定性五、简并引物的设计五、同源引物设计六、网络免费在线引物设计软件六、引物设计常用商业软件包七、PrimerPremier和Oligo引物软件使用方法•常有引物设计软件的引物的自动搜索和评价分析软件的引物设计功能主要体现在两个方面：首先是引物分析评价功能，该功能只有少数商业版软件能够做到，其中以“Oligo6”最优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。据笔者的经验，自动搜索功能以“PremierPrimer”为最强且方便使用，“Oligo6”其次，其他软件如“VectorNTISuit”、“Dnasis”、“Omiga”和“Dnastar”都带有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十分理想。要想得到效果很好的引物，在自动搜索的基础上还要辅以人工分析。笔者认为引物设计软件的最佳搭配是“Oligo”和“Premier”软件合并使用，以“Premier”进行自动搜索，“Oligo”进行分析评价，如此可快速设计出成功率很高的引物。