经典——教你如何选择流式抗体

'.;.经典——教你如何选择流式抗体一、如何搭配流式抗体荧光标记流式抗体荧光标记搭配主要由3个因素决定的：流式细胞仪能检测多少个通道、需要同时检测检测多少个指标、厂家的抗体有多少种荧光标记。如果流式细胞仪的通道越多，那么同一份样本能同时做的表面/胞内标志就越多.A、如何根据流式细胞仪搭配流式抗体流式细胞仪能检测多少个通道是由有多少根激光决定的以及每根激光的功能决定的，所以首先需要注意两点：流式细胞仪有哪些激光。不同型号的流式细胞仪的同样的一个通道检测荧光素的能力是不一样的.B、搭配荧光素原则搭配流式荧光素有2个原则：每个通道只能选择1种荧光素；各个通道之间的荧光素可以随意搭配，但需注意的是，APC和PE-Cy5一起使用的话，上流式以后，容易导致补偿过度。C、如果检测的指标数目超过了流式细胞仪的通道，怎么办？如果需要做5个指标，而流式细胞仪只能做4个通道，首先将指标归成2类，再将样本分成2份，分别检测。比如需要同时检测CD3、CD4、CD8、IL-4和IFN-gamma，那么将样本分成两份，第1份加CD3、CD4、CD8和IL-4，而第2份加CD3、CD4、CD8和IFN-gamma。二、同型对照（IsotypyControl）编辑本段回目录1、为什么要用同型对照？同型对照是使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性与细胞结合而产生的背景染色。同型对照是真正意思上的阴性对照，它不但可以用来设定流式细胞仪的电压，而且还可以帮忙省去昂贵与繁琐的重组细胞因子竞争封闭步骤。在流式细胞仪上样前，染色方式如下：样本管：一抗＋样本同型对照管：同型对照＋样本2、如何选择同型对照？一般选择与一抗的成分完全相同种属来源、相同亚型和亚链、相同荧光标记的抗体，比如抗人的CD56APC标记的抗体，货号是555518,成份是MouseIgG1,κ。那么它的同型对照应该是APC标记的MouseIgG1,κ，货号是555751。注意同型对照的成份跟它的名称是相同的.如果是抗体的组合形式是纯化的一抗＋荧光标记的二抗，那么应该选择一抗的同型对照。比如CDw125的纯化抗体，货号是555901，成分是MouseIgG1,κ。它的同型对照是纯化的MouseIgG1,κ，货号是555746。它的二抗PE标记的抗小鼠IgG1,货号是550083。那么染色方式如下：样本管：纯化的CDw25＋PE标记的抗MouseIgG1＋样本同型对照管：纯化的同型对照＋PE标记的抗MouseIgG1＋样本如果没有找到适合的同型对照，在保持来源相同、荧光标记相同、免疫球蛋白类别相同条件下，那么优先选择的顺序应该是亚链不同－－亚型不同－－相同类别。比如，某种的抗体的来源是MouseIgG2а,κ。如果在同型对照表里面找到不到完全相同的同型对照，那么优先选择相同荧光标记的MouseIgG2а为同型对照。如果也没有找到MouseIgG2а，那么优先选择相同荧光标记的MouseIgG2b作为同型对照。如果最后还是没有找到MouseIgG2b，那么选者相同荧光标记的MouseIgG2作为同型对照。3、哪些人需要使用同型对照？A对流式不是非常熟悉的人。B做胞内流式人，比如胞内细胞因子、趋化因子和信号蛋白等。'.;.C使用不常见的标志或者特异性不高的标志的人，因为实验者不熟悉不常见标志的表达情况，根据同型对照可以判断阳性细胞的位置。一些特异性不高的抗体，如多抗，非特异性结合非常多，使用同型对照可排除假阳性。D对流式非常熟悉又使用常用的表面标志的人一般可以不使用同型对照。4、为什么有时候同型对照的表达会比抗体的表达高？首先需要检查同型对照的抗体是否加错类型、剂量等。其次，因为有些标志在细胞的表面或者胞内表达不高，而跟其类似的抗原非常多，那么加入同型对照时，同型对照非特异性的结合会超过抗体的特异性，所以会造成这种现象，在细胞表面时如图所示。这个时候推荐使用其他阴性对照，如空白对照等。图1三、补充建议，给不熟悉流式抗体选择的人第一看清楚抗的是你的目标蛋白质没错，目标蛋白的物种不要搞错了，有些抗体对好几个物种的目标蛋白有反应，对你的实验有没有影响。第二抗体的物种是小鼠,大鼠,兔子还是什么。虽然现在荧光都标记好了，一般不需要二抗。但最好还是选择你有匹配二抗的一抗，以备不时之需。如果抗体还能够做荧光染色啊，westernblot啊用途多了更好。第三荧光的颜色选择一是你的流式仪一定要能读，二是跟你需要counterstain的其他流式抗体错开频率。第四抗体的球蛋白亚型。因为要根据这个选择isotype对照用抗体。其实严格来说不光亚型一样，浓度也要一样，每个抗体分子携带的荧光分子数量也要一样才行。最好是一个isotype你的好几个抗体都能用，就省了事了。第五到底能测试多少样品。有些产品介绍没说清楚，可以根据推荐的浓度计算一下。一是这样才看出价格高低，二是根据自己需要选择大支还是小支.买多了过期也是浪费。当然也可以看看他们的克隆编号--有些文献会讨论某目标蛋白的各种抗体的特异性哪个好哪个坏，这都是使用者的经验。但一般买抗体没有人这么小心这么麻烦啦。你还可以看制作抗体所用的抗原是什么，有的是肿瘤组织提取液，有的是重组蛋白，有的是肽链片断。选用哪个跟你的实验用途有关。有些蛋白质有很多亚型，也要注意是否测试过跟那些亚型起反应。一个非常重要的，就是单抗还是多抗。也要根据实验性质选择