DPPH自由基清除测定

DPPH自由基清除测定1/2DPPH法测定黄芩黄酮的抗氧化活性抗氧化就是任何以低浓度存在就能有效抑制自由基的氧化反应的物质，其作用机理可以是直接作用在自由基，或是间接消耗掉容易生成自由基的物质，防止发生进一步反应。目前对自由基清除剂的研究方法主要有2类，一类是体外模型，另一类是体内模型，其中DPPH法是体外模型中最常用的方法。DPPH又称1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，是一种很稳定的氮中心的自由基，他的稳定性主要来自共振稳定作用的3个苯环的空间障碍，使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥其应有的电子成对作用。它的无水乙醇溶液呈紫色，在517nm波长处有最大吸收，吸光度与浓度呈线性关系。。向其中加入自由基清除剂时，可以结合或替代DPPH·，使自由基数量减少，吸光度变小，溶液颜色变浅，借此可评价清除自由基的能力。即通过在517nm波长处检测样品清除DPPH·的效果，来计算抗氧化能力。实验研究表明，黄芩黄酮中清除DPPH自由基活性的主要成分是黄芩苷[1]，黄芩苷中含有羧羟基和酚羟基能与DPPH反应，反应式如下：NN+O2NO2NNO2H+NNHO2NO2NNO2DPPH与抗氧化剂反应原理材料：DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）；无水乙醇；仪器：分光光度计1.DPPH贮备液的制备准确称取DPPH试剂3．5mg，用无水乙醇溶解，并定量转入10mL容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，取2mL至100ml容量瓶中，摇匀得浓度为0.0178mmol／LDPPH贮备液，置于冰箱中冷藏备用。2.试液的制备(只作参考)准确称取5.2mg干燥的黄酮提取物（32.75%）,用无水乙醇溶解，并定量转入50ml容量瓶中，用无水乙醇定量至刻度，取10ml至100ml容量瓶中，摇匀得浓度为0.0233mmol／L试液。3.DPPH·清除率的测定在10mL比色管中依次加入4.0mLDPPH溶液和黄酮提取液，再加入无水乙醇至刻度，混匀立即用1cm比色皿在517nm波长处测吸光值(A)，吸光值记为Ai，再在温室避光保存30min后测吸光值，记为Aj，对照试验为只加DPPH的乙醇溶液，其吸光值记为Ac。按下式计算自由基清除率(K)：K(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]*100%DPPH自由基清除测定2/2试验重复三次，取其平均值作为最后结果。[1].刘玉萍,PurusotamBasnet,小松かっ子,曹晖.黄芩清除自由基活性与黄芩苷含量的相关性研究[J].中国中药杂志,2002,27(8):575-579药品：DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）；推荐厂家：上海如吉生物科技发展有限公司；北京诺博莱德科技有限公司；报价：380元/瓶；500元/瓶；规格：1g/瓶；含量：99%；产地：日本进口DPPH稳定性不好，要用时,新鲜配制DPPH浓度要根据样品的活性来定，一般在20-100μg/mL添加DPPH量与样品量比例，是根据样品抗氧化能力，而定的！DPPH分子量:394.321样品+DPPH的读数太大，表明你加进去的样品的抗氧化活性较低，可考虑加大样液的浓度试试，所测的值太大或太小，改变DPPH和黄酮的比例或者浓度。绘制黄酮梯度浓度与DPPH清除曲线，计算IC50（软件），表示其抗氧化活性。IC50值为样品提取液抑制DPPH的吸光度50%时提取物的浓度。