小分子人工抗原的制备方法

1小分子人工抗原的制备常用方法一、碳二亚胺（EDC）法（制备KAN-BSA）1.A液的制备：准确称取BSA20mg，EDC55mg，使之充分溶解于2mL0.01MPBS中，4℃避光搅拌反应6h，得到反应液为A液；2.B液的制备：准确称取卡那霉素标准品50mg，加入1.5mL0.01MPBS中，边加边搅拌，使之充分溶解后所得溶液称为B液；3.将上述B液逐滴加入A液中（边加入边搅拌），密封，避光，在4℃下搅拌过夜；4.待上述反应完后，将反应液转移到处理好的透析袋中，4℃用0.01MPBS透析3d，透析第一天每3h换液一次，以后每8-10h换液一次；5.透析完成后，将偶联产物分装于1.5mlep管中，于-20℃保存备用。本实验将其作为免疫原。二、戊二醛（GA）法（制备KAN-GA-OVA）1.A液的制备：准确称取卡那霉素标准品50mg，量取0.5%戊二醛溶液1mL，2.先后将二者充分溶于2mL0.01M的PBS中，于4℃，避光搅拌反应30min，所得反应溶液称为A液；3.B液的制备：准确称取OVA150mg，将其充分溶于5mL0.01MPBS中，得到的溶液称为B液；4.将上述B反应液逐滴加入到A反应液中，边加入边搅拌，再向反应溶液中加入约5.5mg硼氢化钠，调节溶液pH至8.0，于4℃避光搅拌反应2h；5.用0.01MPBS透析，4℃透析5d，每8h换液一次，透析完成后，将反应液分装于1.5mL离心管中，放于-20℃冻存备用。三、混合酸酐法（制备克百威人工抗原）1.取半抗原克百威（BFNH或BFNB）溶解在DMF（二甲基甲酰胺）中，然后在该溶液中加入等当量的正三丁胺和氯甲酸乙酯，在室温下反应1h；2.取反应液500ul加入到5ml15mg/ml的BSA碳酸缓冲液中，在磁力搅拌下反应2h；3.反应完成后，蒸馏水透析2次；0.8%生理盐水透析；4.紫外扫描测定结合比，于-20℃保存备用。2四、活泼酯法（制备克百威人工抗原）1.克百威半抗原BFNB的合成及纯化1)取一四口烧瓶置于恒温磁力搅拌器上,配置温度计。2)称取1.64g呋喃酚溶解于50mL二氯甲烷(DCM)中,冰浴下加入1.11g三乙胺(Et3N)，搅拌10min；3)将3.04g二(对硝基苯)碳酸酯溶于15mL二氯甲烷中,缓慢滴加到上述反应体系中,缓慢升温至室温,继续搅拌反应1h,TLC板监控反应完成,展开剂为V(石油醚):V(乙酸乙酯)=10:1,此为溶液A;4)称取1.697g经三乙胺碱化的4-氨基丁酸甲酯盐酸盐溶于10mL二氯甲烷中,在冰浴下滴加到A液中,将温度升到室温并继续搅拌过夜;5)用水、饱和食盐水依次洗涤并用无水硫酸钠干燥,滤液真空旋干后用硅胶柱层析纯化,得到半抗原中间体B;6)将B溶于15mL1,4-二氧六环溶液中,加人18mL三氟醋酸和15mL水,60C反应4h后冷却至室温;7)反应液用乙酸乙酯萃取后，依次用水、饱和碳酸氢钠、水、饱和食盐水进行洗涤,用无水硫酸钠干燥,滤液真空旋干后用硅胶柱层析纯化后即可得到克百威半抗原BFNB，洗脱剂为V（石油醚）:V（乙酸乙酯）=5:1；2.半抗原BFNB鉴定将纯化后的克百威半抗原BFNB采用核磁共振仪和LC-GC进行分子结构鉴定，已确定半抗原是否合成成功；3.完全抗原的合成1)免疫原（BFNB-BSA采用活性酯法进行合成，控制半抗原BFNB与载体蛋白BSA的反应摩尔比为80:1；2)称取29.3mg半抗原BFNB，13.8mgNHS溶于1ml无水DMF中，充分溶解完全；3)加入24.3mgDCC（N,N'-二环己基碳酰亚胺）室温搅拌反应过夜；4)离心去沉淀，收集上清，此为A液；5)称取BSA83mg溶解在5ml0.01mol/LPBS溶液中，为B液；6)在冰水浴中，将A液逐滴滴加到B液中，4℃搅拌过夜；7)反应混合液用PBS缓冲液透析3d，6-8h换液1次，离心取上清，分装于0.5ml离心管中，-20℃保存备用。8)包被原（BFNB-OVA）在合成中，载体蛋白为OVA，半抗原BFNB与OVA的反应摩尔比为40:1，其余步骤与免疫原的合成相同。