A126-基础化学-第十三章-分光光度法

可见分光光度法和紫外分光光度法第十三章孙静化学教研室1.光的性质及物质对光的选择性吸收(了解)2.分光光度法的基本原理,Lambert-Beer定律及有关计算(掌握)3.分光光度计的基本构造,熟悉标准曲线法(了解)4.提高测量灵敏度和准确度的方法(了解)5.紫外分光光度法的一般概念(了解)本章内容▲分光光度法的基本原理及Lambert-Beer定律▲可见分光光光法的测量方法。-----重点分光光度法（spectrophotometry)定义：根据物质的吸收光谱及光的吸收定律对物质进行定性、定量分析的一种方法原理：吸收光谱～物质结构的内部特征定量分析：确定某一成份或某一化合物存在多少定性分析：确定某一成份某一化合物是否存在分光光度法的分类光源波长范围(nm)类型380~780可见分光光度法200~380紫外分光光度法780~3×105红外分光光度法分光光度法特点：▲灵敏度高:10-5~10-6mol/L最低浓度▲准确度较高▲操作简便、快速▲应用广泛分光光度法的应用例：阿司匹灵（乙酰水杨酸）片剂中水杨酸的鉴别阿司匹灵易吸收空气中的水份而水解产生水杨酸，而水杨酸容易刺激胃。国家药监局规定：水杨酸的含量≤0.1％紫外分光光度法，在λmax=312nm处进行测定例2：紫外分光光度法广泛用于生物试样中蛋白质（λmax=280nm），核酸的纯度分析（λmax=260nm）例3：食品(果酱、果汁、肉制品)中苯甲酸盐、山梨酸盐含量的测定山梨酸盐等常用作食品添加剂以抑制酵母和霉菌的生长,食品工业上对其用量一般有严格限定(如：果酱≤0.1％)苯甲酸盐的石油醚溶液(λmax=225nm)处有最大吸收峰；山梨酸盐的石油醚溶（λmax=250nm）处有最大吸收峰。第一节物质的吸收光谱1、光的基本性质•光是一种电磁波，具有波粒二象性。光的波长（λ）、频率（ν）与速度（c）的关系如下：E=hν=hc/λc＝λν波长短，能量大，穿透力强；波长长，能量小，穿透力弱。一、物质对光的选择性吸收2.物质对光的选择性吸收▲物质对光的吸收具有选择性例：石英可见光几乎不吸收光学：▲物质对光的吸收是物质的普遍性质红外光强烈吸收物质对光的吸收是物质(分子、原子、离子等)与辐射能相互作用的一种形式，只有当入射光的能量同吸光物质的基态和激发态能量差相等时才会被吸收物质对光的吸收：△E=光子能量(hγ)M(基态)+hγ→M(激发态)2.物质对光的选择性吸收▲物质呈现的颜色与光有着密切的关系，不同波长的可见光可使眼睛感觉到不同的颜色。可见光各种颜色光有波长范围紫外紫蓝青绿黄橙红红外400450480500560600650760800nm3.物质颜色与吸收光的关系▲单色光：具有单一波长的光▲复合光：由不同波长光组成的光白光（日光、白炽灯光等）：由不同颜色的光按一定强度比例混合而成▲互补色光：两种颜色的光按适当的强度比例混合可成白光，则这两种光互称为～三个概念物质对光的吸收——有选择性溶液对各种色光不吸收全吸收▲溶液的颜色溶液选择吸收了某种颜色的光，则溶液呈现吸收光的互补色光的颜色无色透明黑色图示：CuSO4溶液呈蓝色复合光黄色光被吸收溶液呈蓝色硫酸铜溶液红橙黄绿青青蓝蓝紫◆对角上的颜色称为互补色光◆物质的颜色与吸收光颜色为互补色光▲物质颜色与吸收光颜色的关系白光物质的颜色和其吸收光颜色的关系物质的颜色吸收光颜色黄绿黄橙红紫红紫蓝绿蓝蓝绿黄绿黄橙红紫蓝绿蓝蓝绿绿λ/nm400～450450～480480～490490～500500～560560～580580～600600～650650～760吸收光谱(吸收曲线)(absorptionspectrum)图12-3不同波长KMnO4溶液吸收光谱▲当浓度改变时λmax位置不变(525nm)物质种类～λmaxA～C0.20.40.60.8ⅠⅡⅢ400450500波长550600650Ⅰ20mg／LⅡ40mg／LⅢ60mg／LnmA二、物质的吸收光谱？定性分析：由于不同物质结构不同，因此，吸收的紫外光波长也不同，利用这一性质可以鉴别物质。定量测定：同一物质的稀溶液，浓度大的吸光度的值较大，反之则较小，利用这一性质可进行定量测定。λmax是定性分析的依据A是定量分析的依据第二节分光光度法基本原理一、透光率和吸光度图13-3光通过溶液的情况I0ItbI0=Ia+It+IrI0=Ia+ItIrIaT＝It／I0T:透光度(transmittance)或百分透光率(T%)A:吸光度(absorbance)A=-lgT=lgI0／It二、朗伯-比尔定律（光吸收定律）Lambert-Beer定律I0ItbLambert定律：A=k1bA=εbcBeer定律：A=k2cLambert-Beer定律：T=10-εbcA=-lgT图13-3光通过溶液的情况公式适用范围▲单色光▲均匀溶液(稀溶液)气相、均相固体▲可见光区，紫外、红外区式中b的单位cmc为物质的量浓度，单位为mol·L-1ε称为摩尔吸光系数单位:L·mol-1·cm-1A=-lgT=-lgIt/I0=εbc若用质量浓度ρ(g·L-1)代替物质的量浓度c，则A=abρa为质量吸光系数单位L.g-1.cm-1ε=aMBA=εbcε(a)：衡量吸光光度法的灵敏度▲是有色物质的特征常数ε(或a)值说明：▲与c、b无关与入射光波长物质本性溶剂，温度有关;测定时，取λmax，ε值最大,显色反应最灵敏（104~105）测定使用的ε值，如不特别注明，通常指在λmax条件下测定的化合物组成不明，物质的相对分子质量(M)不知道，物质的量的浓度无法确定，无法使用摩尔吸光系数(ε)医学上常用比吸光系数E1cm1%符号：比吸光系数（specificabsorptivity)E1%表示单位：mL·g-1.cm-1与ε关系：时的吸光值浓度:1%(g·mL-1)b:1cm1cmE1%=10×1cmεMB与a关系：a=0.1E1%1cm三、吸收度的加和性内容：多组分体系中(a,b,c,···)，在某一波长(λ)，如果各种对光有吸收的物质之间没有相互作用，则体系在该波长的总吸光度等于各组分吸光度之和，即吸光度具有加和性。表示式：A总＝Aa+Ab+Ac+···－－分光光度法中分析测定混合物中各组分的依据意义?四、相关计算1.A=-lgT=-lgIt/I0=ε·b·c2.ε～a～ε=aMBa=0.1E1cm1%E1cm1%E1cm1%=10×ε/MB例1：已知Fe2+：500μg·L-1b：2cmA：0.19(λ508nm）求ε，E1%?1cm解：c(Fe2+)==8.9×10-6mol·L-1A=εbc500×10-655.85ε=Ab·c=1.1×104(L·mol-1·cm-1)=0.19/(2×8.9×10-6)=10×=2.0×103(mL·g-1·cm-1)1.1×10455.85E1cm1%=10×ε/M例13-1：教材P252已知某化合物的相对分子质量为251，将此化合物用乙醇作溶剂配成浓度为0.150mmol·L-1的溶液，在480nm波长处用2.00cm吸收池测得透光率为39.8％，求该化合物在上述条件下的摩尔吸光系数ε和质量吸光系数a？ε=Ab·c解:已知c＝0.150×10-3mol·L-1b＝2.00cm，T＝0.398代入公式:=﹣lg0.398∕(1.50×10-4mol·L-1×2.00cm)a=ε∕Mε=1.33×103L·mol-1·cm-1据公式:=1.33×103∕251=5.30L·g-1·cm-1例13-1：教材P252已知某化合物的相对分子质量为251，将此化合物用乙醇作溶剂配成浓度为0.150mmol·L-1的溶液，在480nm波长处用2.00cm吸收池测得透光率为39.8％，求该化合物在上述条件下的摩尔吸光系数ε和质量吸光系数a？小结：2.Lambert-Beer定律A=-lgT=-lgIt/I0=ε·b·cE1cm1%三个吸光系数：εa1.物质对光的选择吸收第三节可见分光光度法(spectrophotometry)▲原理和特点原理：根据Lambert-Beer’slaw白光→单色光→有色溶液→A值→求被测物含量一、分光光度计(spectrophotometer)主要部件1、光源：钨丝灯（λ320~3200nm）稳定，足够光强度2、单色器：获取单色光棱镜或光栅3、吸收池：比色皿（石英、玻璃）4、检测器：光电管5、讯号处理及显示器：指针式微安表图13-4(b)混合光在棱镜中的色散6006002、单色器准直镜棱镜出光狭缝入光狭缝白光→入光狭缝→准直镜→棱镜或光栅→色散后的光→准直镜→出光狭缝→转动棱镜或光栅→出光狭缝处获单色光图13-4(a)单色器示意图2、单色器4、检测器：光电管两极间加电压，线路中产生电流，光电流大小与照射光强度成正比光电管工作线路示意图光光敏阴极阴极表面放电子入射光放大器记录器+-阳极阴极(光敏材料如氧化铯)高电阻5、指示器图13-5吸光度与透光率标尺2.01.00.70.60.50.40.30.20.150.10.050102030405060708090100AT(%)-------721型分光光度计采用指针式的微安表-A的刻度不均等?配制一系列标准溶液显色分别测定其A值（λmax）绘制标准曲线测A待测(条件同上)从标准曲线上求c待测A二、测定方法（一）标准曲线法c····Axcx标准曲线图选择适宜的空白溶液（参比溶液）用空白（参比）溶液调节透光度为100%以消除吸收池壁及溶剂对入射光反射和吸收带来的误差（二）标准对照法cx=AxAs·cs配制标准溶液cs测As同条件下测被测液Ax按上式求算cx注意：（1）溶液符合朗伯-比尔定律（2）cs和cx尽量接近第四节提高测量灵敏度和准确度的方法第五节紫外分光光度法简介(自学)本章要求分光光度法（分光光度计）：原理、特点、基本概念1.吸收定律及其计算2.仪器的主要组成部件及其作用3.标准曲线的绘制方法及其应用A=-lgT=KbcA=abρA=εbcE1%1cm=10εMrε=aM本章作业：P261第6，10题