乳鼠肺组织细胞培养系列实验

报告一乳鼠肺组织细胞原代培养器材设备CO2恒温培养箱、超净工作台、倒置显微镜仪器眼科剪（尖头弯头）、眼科镊、培养瓶25m1或50m1、表面皿、培养皿、吸管、小烧杯、青霉素小瓶、吸管橡皮头、橡皮瓶塞、酒精灯、试管架、记号笔、75%酒精棉球上述器材均须彻底清洗、烤干、包装好试剂已配制好的1640培养液含20%FBS（小牛血清）、已配制好的D-Hanks液、75%酒精、实验步骤1.取材：取1-3d新生乳鼠，鼠身浸入75%酒精中消毒后去除移入工作台内将乳鼠仰位固定。在胸线正中线中位处，用眼科弯镊（第一套器械）夹起皮肤拉开，是躯干肌肉暴露酒精消毒胸廓后，沿膈膜剪断胸廓，剪短肋骨，暴漏胸廓，取眼科镊（第三套器械）弯头段向上将肺取出，立即移入加有Hanks液的青霉素瓶内。2.漂洗：用习惯吸取Hanks液漂洗肺脏表面血污粗剪：用剪刀粗剪几下，再用Hanks液漂洗多次后，洗去多于液体3.细剪：将组织小块置于青霉素瓶一角，用眼科直剪反复剪切组织块，直至成1mm3大小。4.制备肺组织单细胞悬液：用吸管吸取少许Hanks液（约5ml）于细剪后的组织块上，反复吹打均匀，获取细胞悬液。5.接种：取25ml培养瓶一个，在侧面做好标记（培养物的名称组号和日期），用吸管吸取1ml细胞悬液接种于培养瓶的接种面，再加入4ml左右全培养液混匀（将接种面覆盖即可）。加瓶盖移入37摄氏度5%CO2温箱中培养XX天结果在倒置相差显微镜下观察培养瓶中的细胞已铺满培养面且贴壁生长，已形成致密单层细胞注意事项：1.皮肤严格消毒、三套器械取材、严格无菌操作，防止杂菌污染。2.器材使用时要注意过过火焰消毒，但要一定要冷却后再使用，避免烫伤烫死细胞。3.培养瓶要在超净台内才能打开瓶塞，打开之前和加塞前瓶口都要在酒精灯上烧一下，打开瓶口后的操作全部都要在超净台内完成。操作完毕后，加上瓶塞，才能拿到超净台外。使用的吸管在从消毒的铁筒中取出后要手拿末端，将尖端在火上烧一下，戴上胶皮乳头，然后再去吸取液体。总之，在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯的周围进行。报告二细胞的传代培养材料和试剂1、试剂：0.25％胰蛋白酶TE、FBS-1640培养基（含20％小牛血清）、已配制好的D-Hanks液2、仪器和器材：CO2恒温培养箱、超净工作台、倒置显微镜，50ml培养瓶、玻璃吸管、吸管橡皮头、橡皮瓶塞酒精灯、试管架、记号笔、75%酒精棉球、酒精灯等操作步骤1、去原瓶培养液将培养瓶从培养箱中取出镜下观察已形成致密单层细胞，点燃超净工作台中的酒精灯。在酒精灯旁将已形成致密单层细胞的乳鼠肺组织细胞的培养瓶中原来的培养液吸去，加入1-2mlHanks液冲洗组织块2次后倒去多余的Hanks液。2、消化：加入1~1.5ml0.25％Trypsin（胰酶溶液），使板底细胞都浸入溶液中，静置2-3min后去掉多余的Trypsin，剩少许，将培养瓶放于倒置显微镜下观察继续消化约5min左右(观察到大部分细胞出现胞质缩回、细胞趋向圆球形、细胞间隙增大时即可)。3、终止消化制备细胞悬液吸取全培于25ml培养瓶中，并经瓶壁冲洗细胞将贴壁的细胞反复吹打成悬液。4、分瓶扩大培养转移吹打均匀的细胞悬液至50ml培养瓶中并加入2管培养基。前后左右的来回震荡使细胞分散均匀后，将培养板放入培养箱6.收拾整理超净台附：消化液配制方法：称取2.5克胰酶蛋白酶，加入100ml10xPBS+纯水溶解到1L，滤器过滤除菌，4℃保存，用前可在37℃下回温。10xPBS配方：Na2HPO4(14.2g)KH2PO4(2.32g)NaCl(80g)KCl(2.02g)(调至PH=7.4）五、实验结果传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶壁上，2天左右就在瓶内形成单层，达到七八成满。这时需再次传代注意事项1.消化时如果未见空隙说明消化程度不够可将消化时间稍延长如果发现细胞已大片脱落说明已消化过头在这种情况下不能倒出消化液而应直接进入下步操作。2.注意吹打时要轻，避免产生过度气泡，污染细胞悬液。3.六、讨论与反思实验三制备细胞爬片复苏细胞细胞的计数及活力测定一．传代、制备细胞爬片：（1）原代细胞弃培养基，Hanks液漂洗（2）加胰酶（半吸管）消化5min(3)加全培（1吸管）并吹打20-30下（4）培养板中放入无菌盖玻片（5）将细胞悬液加在板内盖玻片上。（6）板内补充足量全陪（1吸管/孔）二．复苏细胞爬片：（1）取冻存的A549细胞手握融化（2）离心1000rpm.5min，弃上清液。（3）全培重悬细胞沉淀，轻轻吹打均匀。（4）细胞悬液接种培养板内盖玻片，步骤同上4-6步三．细胞活力测定（1）去1d细胞悬液滴在载玻片中央（2）再滴一滴台盼蓝溶液染色（3）加盖玻片，低倍镜下计数时间不超过3min，无色为活细胞，蓝色为死细胞数100个细胞，计算活细胞百分比。四．细胞计数：取细胞计数板，盖上盖玻片，吸取细胞悬液滴于计数板上，然后置于倒置显微镜下，开始计数，数四个格子的细胞数，然后利用公式（1+2+3+4）/4*104=N/ml