HPLC---液相色谱入门-Waters

HPLC-液相色谱入门什么是液相色谱?历史概述和定义液相色谱的定义是二十世纪早期由俄罗斯植物学家MikhailS.茨维特提出的。他最先尝试在装满颗粒的柱子上使用溶剂来分离从植物中提取的化合物[树叶色素]。茨维特用颗粒填满开口的玻璃柱。他发现两种特殊的材料，粉笔末(碳酸钙)和氧化铝很有用。他将样品[混匀植物叶的溶剂提取物]倒入柱中，并让样品流过颗、粒床。随后加入纯溶剂。随着样品由于重力自上而下流过柱子，可看到不同颜色的谱带被分开，因为有些组分比另外一些移动得快。他将这些分开的不同颜色的谱带与样品中原有的不同化合物相关联。他还根据每一种化合物对填料的化学亲和性强弱，提出了分析这些化合物的分离规律。与颗粒填料有较强亲和性的化合物移动慢，与溶剂有较强亲和性的化合物移动快。这个过程可这样描述:样品中的化合物在流动的溶剂(流动相)与固体颗粒(固定相)间的分布不一样。这样使每一种化合物以不同的速度移动，从而产生了化合物之间的分离。茨维特使用色谱法chromatography[来自希腊字，chroma意思是颜色，graphy意思是记录-直译为颜色记录]来描述他的彩色试验。[令人好奇的是,俄罗斯名字茨维特意思是颜色。]今天，液相色谱法,以各种形式，已成为分析化学中最有力的工具之一。技术1.样品被点在固定在玻璃板上的薄层色谱颗粒[固定相]上，并流过薄层[图B]。玻璃板的底端放置在溶剂中。由毛细作用产生的流动使溶剂[流动相]扩散到干燥的颗粒层并沿玻璃板向上移动。这种技术被称为薄层色谱法或TLC。技术2.在图C中,样品被点在纸上[固定相]。溶剂[流动相]加在样品点的中心以产生向周围的辐射流动。这是纸层析的一种方式。[传统的纸层析色谱和直线流动的薄层色谱是类似的操作方式。]上图中，相同的黑色FD和C染料被点在纸上。图C:纸层析法当和薄层色谱板比较的时候，请注意这种特殊纸张分离能力的区别。绿色圆环表示这张纸无法分离黄色和蓝色染料，但它可以将红色染料分离开来。下图中，由同样的黄色和蓝色染料组成的一个绿色样品点在纸上。如你能预料的，这张纸无法分离这两个染料。在图中，由红色和蓝色组成的紫色样品被点在纸上，它们被分离得很好。技术3.在这个最有效的方法中，样品流进一个柱子或填有适当颗粒[固定相]的柱管装置。这些颗粒称为色谱填料。溶剂[流动相]流过这个装置。在固相萃取中[SPE]，样品被装入柱管里，溶剂携带样品流出这个装置。正如在茨维特的试验中，样品中化合物由于在管路中的流动速度不同而得以分开。黑色样品被放入柱管里。每一步使用不同溶剂得到分离。图D-1:柱色谱法-固相萃取[SPE]当使用管路的形式时，有几种方法可以产生流动。重力或真空可用在不能承受压力的柱子上。特别是，本试验中使用的颗粒粒径较大[大于五十微米]，所以产生的流动阻力很小。开口玻璃柱[茨维特的实验]是个典型的例子。除此之外，小型塑料柱，典型的例子是针筒的形状，可装入填充物颗粒用于分离样品。这种方法称为固相萃取[SPE]。在此，管状的色谱装置称为固相萃取小柱，通常在真空助力下流动，被用来净化复杂样品以便进一步分析。要想提高分离能力，必须使用粒径小的填料颗粒[小于十微米]。然而，小颗粒对流动产生更大的阻力，所以要获得预期的溶剂流速，需要更高压力。必须设计能承受更高压力的泵和柱子。利用中高压力使溶剂流过色谱柱的方法，就称为HPLC。图D-2:HPLC柱什么是高效液相色谱法[HPLC]?缩写HPLC,引自CsabaHorváth教授之后在1970年匹茨堡大会上的文章，原指在填料柱中产生所需的流速需要高压(high-pressure)这个事实。早期的泵只能承受500psi[35bar]。这就被称为高压液相色谱法[HPLC]七十年代早期取得极大进步。新型的高压液相色谱仪器可以承受6,000psi[400bar]的压力，还能配上改进的进样器，检测器和色谱柱。高压液相色谱法确实开始成为二十世纪七十年代中晚期的普遍分析方法。随着这一期间不断的性能改进[更小颗粒，更高压力],字母缩写保持一样，但全称变为高效(high-performance)液相色谱[HPLC]。高效液相色谱[HPLC]是目前分析化学最强大的工具之一。它能够分离、定性和定量任何可以溶解在液体中的化合物。今天，痕量化合物甚至低至千万分之一[ppt]也可。一个储液瓶装有溶剂[称为流动相，因为溶剂是流动的]。一个高压泵[溶剂传输系统或称溶剂管理器]用来产生和计量流动相的流速，一般是毫升/分钟。一个进样器[样品管理器或自动进样器]可以将样品导入[注射]连续的流动相，并由流动相携带样品进入高效液相色谱柱。色谱柱装有能获得分离效果的填料。这种填料称为固定相因为它被柱硬件包围住。检测器用来查看化合物流出色谱柱时被分开的谱带[大多数化合物没有颜色，所以人眼观察不到]。流动相流出检测器可被送至废液瓶，或按需被收集。当流动相含有一个分开的化合物谱带，高效液相色谱可以收集含有纯化的化合物的该洗脱组分，用于进一步分析。这种方法称为制备液相[在高效液相色谱量级中讨论]。注意高压管路和附件用来连接泵、进样器、色谱柱和检测器单元，形成流动相、样品和化合物分离谱带的通路。图E描述了高效液相色谱系统的各组成部分检测器连接计算机数据站，高效液相色谱系统单元先记录电信号，再将电信号转换为色谱图，在显示屏上展现出来。定性和定量样品内溶物浓度(如图F)。由于样品中化合物性质差异很大，几种类型的检测器被开发出来。例如，如果一个化合物能吸收紫外光，可使用紫外吸收检测器。如果这个化合物发荧光，可使用荧光检测器。如果该化合物没有上述性质之一，可使用更广泛的检测器，如蒸发光散射检测器[ELSD]。最强大的方式是顺序使用多个检测器。例如，紫外和/或蒸发光检测器可和质谱仪[MS]联用来分析色谱分离的组分。这样，从一次进样，可得到分析物的更多综合的信息。将质谱与高效液相色谱系统耦合称之为液质用.图H中，三个时间上分开的色谱峰代表三个染料化合物。每一个洗脱物在一个特定的位置，时间段计算从进样[零时]到峰最高点洗脱出来为止。比较每个峰的保留时间[tR]和注入同一色谱系统的标准物质[相同流动相和固定相]的保留时间，色谱工作者就可能鉴定每一个化合物。图I-1中出示的色谱图，色谱学家已经知道，在设定的液相条件下，分析物丙烯酰胺可以被分离并在2.85分钟[保留时间]从柱中洗脱下来。当任何一个新样品含有丙烯酰胺时，在相同的液相条件下，都会在2.85分钟出现色谱峰[如图I-2种样品B]。[欲进一步了解为什么有些化合物比另外一些移动得慢[更强保留]，请参考28页高效液相色谱分离模式]。当鉴定完成后，下一个重要的信息是样品中每一个化合物的含量是多少。来自检测器的色谱图和相应数据帮助我们计算每种化合物的浓度。检测器基本上反映化合物谱带通过流通池的浓度。浓度越高，信号越强，这可从基线上色谱峰高度观察到。FigureI-2:IdentificationandQuantitation图I-2中，样品A和B的色谱图，在同一时间段相互重叠。两个样品的进样体积是一样的。两张色谱图在保留时间[tR]2.85分钟时都出现了一个色谱峰，表明每个样品都含有丙烯酰胺。然而，样品A显示出一个明显变大的丙烯酰胺峰。峰下面的面积[峰面积计算]是测量化合物浓度的一种方法。峰面积数值是由计算机数据站自动积分和计算。在这个例子中，样品A中丙烯酰胺的峰面积是样品B中的十倍。利用标准样品对比，可以推断样品A含有10pg丙烯酰胺，是样品B中丙烯酰胺含量的十倍[1pg]。注意另外一个峰[没有鉴定]在两个样品中的洗脱时间都是1.8分钟。由于峰面积在两个样品中大致相同，因此这个未知化合物可能在两个样品中含量相同。等度和梯度液相系统操作高效液相色谱使用两种基本的洗脱模式。第一种称为等度洗脱。在这种模式下，流动相，无论是纯溶剂或混合物，在整个操作过程中保持不变。一个典型的系统如图J-1所示。第二种称为梯度洗脱，正如名称所指，流动相的组成在分离过程中发生变化。这种模式对含有多种不同色谱极性化合物的样品非常有用[参见高效液相色谱分离模式]。随着分离的进行，流动相的洗脱强度逐渐增强以洗脱出更强保留的样品组分。最简单的一个例子，如图J-2所示，有两个溶剂瓶和两个泵。每个泵的流速由梯度控制器管理，在分离过程中传输或多或少的溶剂。两种溶剂在混合器中混匀形成实际流动相，再传输到色谱柱上。起始阶段，流动相含有大比例的弱溶剂[溶剂A]。一段时间以后，强溶剂[溶剂B]的比例增加。注意图J-2中，混合器是两个泵的下游，因此，梯度是在高压下产生的。另一种高效液相色谱系统可设计为在泵前低压条件下混合多种溶剂。一个梯度比例阀从四个溶剂瓶之间选择溶剂，随时间改变流动相强度[如图J-3]。高效液相色谱量级[分析，制备和工程]我们已经讨论了高效液相色谱如何提供分析数据，用于定性和定量样品中的化合物。然而，高效液相色谱也可以用来纯化和收集所需的每一个化合物，在流通池下游使用组分收集器。这个过程被称为制备液相[如图K].在制备液相中，科学家可以收集每个流出色谱柱的组分[例如：在本例中，黄色，之后红色，之后蓝色]。图K:高效液相色谱系统用于纯化：制备色谱法馏分收集器在特定的时间段，选择收集纯化了的组分。收集瓶可移动，从而使每瓶只收集单个峰的组分。科学家确定纯化的程度和数量的目标。结合样品的复杂性，所需组分相对基质的性质和相浓度等考虑，这些目标，又决定了需要处理的样品量和高效液相色谱系统的处理量。总的来说，随着样品量的增加，高效液相色谱柱尺寸将会加大，泵也会需要更高的体积流速。决定一个高效液相色谱系统的处理量称为选择高效液相色谱的量级。表A列出各种高效液相色谱的量级及其色谱分离目标。通过特定地匹配HPLC的固定相和流动相来最大化选择性-即获得两组分的最大分离度-在决定一个分离过程所需时很关键[参考讨论高效液相色谱分离模式]。容量成为衡量匹配上样量的柱体积[Vc]和选择适当颗粒[决定压力和效率，参考分离能力的讨论]的关键。柱体积，填料床长度[L]和内径[i.d.]，决定填料多少。(如图L).FigureL:HPLCColumnDimensions总的来说，高效液相色谱柱长度[L]在20毫米到500毫米之间，内径[i.d.]在1毫米到100毫米之间。随着色谱量级的增加，柱尺寸增加，横截面积增加。为了优化通量，流动相流速必须与横截面积成比例增加。如果较小的颗粒要获得更强分离能力，泵必须设计成能承受更高反压下的更高流动相体积、流速。表B列出一些简单的挑选准则，为每种色谱量级推荐的色谱柱直径和颗粒尺寸范围。例如，半制备级液相[红色X]可以用内径10-40毫米装5-15微米的颗粒。柱长度可根据需要纯化的化合物的量和要求分离的程度计算出来。当你放大分离处理量时，沃特世制备计算器软件CD可以帮你恰当地选择色谱柱和设定其他操作参数，如流速。请浏览。高效液相色谱柱硬件一个色谱柱管路和配件必须填有决定分离效果的色谱柱填料[固定相]。它必须能够承受生产过程和使用中的反压。而且，它必须是样品入口和分离的谱带出口控制良好[无泄漏，最小体积和零死体积]的流路，而且相对于分离系统[样品，流动相和固定相]来说具有化学惰性。为承受尽可能高的压力，大多数色谱柱由不锈钢制成。当分析特殊化学品或生物制品需要惰性表面材料时，也可能会用到尽管只能承受较小压力的PEEKTM[一种工程塑料]和玻璃[图M-1]。玻璃制色谱柱壁有视觉优势。在图M-2的照片中，当样品谱带还在色谱柱中，传输被停止。你可以看到样品混合物中的三种染料已经在床层中分开，黄色分析物移动最快，将要流出色谱柱。图M-2:色谱柱内部分离性能-分离度两种化合物分离的程度称为色谱分离度[RS]。由色谱柱决定的总体分离能力或分离度的两个主要的因素是，机械分离能力：由色谱柱长度，粒径和填料床层的均一性决定，和化学分离能力：由填料和流动相对化合物的物化竞争决定。效率是衡量机械分离能力的指标，选择性是化学分离能力的指标。机械分离能力-效率如果