生物大分子药物色谱表征入门指南

安捷伦科技生物大分子药物色谱表征入门指南生物大分子药物表征概述...................................................................................................04肽图分析指南......................................................................................................................08糖谱分析..............................................................................................................................20亲和色谱测定抗体滴度.......................................................................................................28体积排阻色谱分析蛋白质聚集体和降解产物...................................................................36采用反相色谱进行蛋白鉴定与杂质分析............................................................................42离子交换色谱表征蛋白质电荷异构体...............................................................................503目录生物大分子药物表征概述一、生物大分子药物表征与质量控制过去，大多数药物都是化学合成的小分子。如今，随着越来越多的小分子药物专利过期以及来自非专利仿制药物的强大竞争，特别是生物药物的靶向治疗优势日益凸显，生物药物逐渐占据了重要的市场份额，并显现出巨大的增长潜力。生物药物可以是RNA（如microRNA）、寡聚核苷酸、多肽或者蛋白质。凭借细胞特异的作用方式和相对低的化合物特异毒性，这类药物取得了巨大的成功。其中蛋白治疗药物的发现和开发正在快速增长，不久将会赶上甚至超过化学药物。在下面的讨论中，主要关注蛋白类生物大分子药物。小分子药物一般通过化学合成得到，其结构非常清楚，但是治疗用蛋白质药物的生产和表征都很困难。这些蛋白质是从各种生物基质中分离得到，一般是由紧密相关的不同分子量和不同电荷的异构体组成的不均一混合物。它们从活细胞中得到且往往包含多种与产品和工艺相关的杂质。此外，重组蛋白还常常出现复杂的翻译后修饰，具有部分依赖二硫键的高度特异的三维结构，并且可能发生聚集、吸附和截短。因此，全面的化学、物理和构像表征对于了解重组蛋白药物的异质性、杂质谱和有效性是非常必要的。准确的氨基酸序列、分子量、价态变化、糖基化、聚集水平以及氧化水平都是蛋白质药物表征的关键要素。对于杂质，尤其是那些可能诱导发热反应或免疫反应的化合物必须进行鉴定、表征并尽可能减少其在最终产品中的含量。为了减少氧化和水解等化学变化导致的药物降解，延长药效持续时间，合适的剂型设计也非常重要。因此，准确并且可重复的表征方法对于支持和指导药物生产以及制剂决策不可或缺。和所有其他药品一样，生物药品的原料药和终产品也必须进行严格的质量控制。必须对产品的成份、杂质、含量（如蛋白质含量）和稳定性进行检测，保证生物药品的安全性和有效性。全面的质量控制也是所有GMP法规的要求，是监管检查的重点。传统小分子药品与生物药品表征和质量控制（QC）的最根本区别在于两者用于测定产品特性（同一性、效价、纯度和杂质谱）的方法不同。这是因为两者的产品性质截然不同。由于其高度的复杂性，生物技术产品的分析过程更为复杂。蛋白质分子的分子量比传统药物大2～3个数量级。原料药来源于活体细胞，通常含有一系列复杂的产品和工艺相关杂质。另外，蛋白质还经过复杂的翻译后修饰，有高特异性的三维或四维结构，可能发生聚集和/或吸附作用。4尽管分析仪器已经有了很大的进步，仍然无法对所有生物技术药品进行完全的表征。因此，监管部门和生物制药行业没有使用“完全表征的生物药物（FullyCharacterizedBiologicalDrugs）”这样的术语，而是代之以“良好表征的生物药品（WellCharacterizedBiologicalDrugs,WCBD）”。国际人用药注册技术协调会议（ICHQ6B，测试方法和接受标准:生物技术和生物药品，SPECIFICATIONS:TESTPROCEDURESANDACCEPTANCECRITERIAFORBIOTECHNOLOGICAL/BIOLOGICALPRODUCTS)建议通过理化性质、生物活性、免疫化学活性、纯度和含量来表征产品。1、理化参数理化参数包括一级结构、组成和理化性质的测定。一级结构的信息可以结合肽图、C-端和N-端序列、氨基酸组成和序列等一系列结果来确定。蛋白质的高级结构也很重要，因为它们对药品的活性有显著影响。高级结构的数据可以通过光谱方法获得，如圆二色光谱（CD）和核磁共振（NMR）。还应采集其他理化特性数据，如分子量或分子大小、异构类型、消光系数和电泳图谱。鉴别、同质性和纯度的数据也可以通过多种液相色谱法、质谱或液质联用等技术进行采集。2、生物活性生物活性的测定很重要，因为它决定了药物的治疗效果。生物活性的数据给出了功能信息，同时还间接地给出正确的蛋白质折叠信息。用于测定生物活性的方法包括基于动物的生物测定法、细胞培养测定法和生物化学测定法。生物测定的结果应当表达成活力单位，并用商品化或自制标准物质为对照进行校正。特殊情况下，也可以用理化试验代替生物测定法进行生物活性的检测。这种情况下，结果应表达为质量单位。3、免疫化学性质如果预期产品为抗体，则应完整地表征其免疫化学性质。应通过与纯抗原和特定种类抗原的抗体结合试验来测定抗体的亲合力、活力和免疫活性。蛋白质的免疫化学性质可用于确定其身份、同质性或纯度。4、含量与杂质产品中蛋白质的含量通常用紫外分光光度法测定。紫外吸收法最适用于纯度极高的蛋白质，因为其他蛋白质的存在可能干扰检测结果。测定最大吸收波长处的吸收值，再根据经验的消光系数计算蛋白质含量。蛋白质类药品中的杂质可以分为两类：产品相关的杂质和工艺相关的杂质。工艺相关杂质由细胞、细胞培养基或纯化过程产生。这类杂质有宿主细胞的DNA、蛋白质、细胞培养基组分（如生长激素），以及下游工艺或是纯化工艺本身可能用到的物质等（如酶、化学和生化过程中使用的试剂、无机盐、配体和其他浸出物）。产品相关杂质为氧化、异构化等修饰产生的杂质，以及脱酰胺基、聚合和截断等翻译后修饰产生的杂质。表1是生物药品检验项目示例，从列出的检测方法可以看到，现代仪器分析方法，包括液相色谱法、核磁共振法、质谱法等已经逐渐成为生物大分子药物表征的不可或缺的手段，特别是在理化参数以及含量与杂质检测方面具有不可替代的作用。作为全球领先的分析测量专业公司，安捷伦提供的测量工具可让您对于了解生物分子在整个开发过程中的确切状态满怀信心。我们的解决方案提供稳定可靠的分析方法，能确保对生物药物的透彻表征以及向质量控制的顺利转移。在这本小手册中，我们专注于各种色谱分离模式在生物药物表征中的应用。如您需要有一个整体的了解，请参考生物药物开发和QA/QC领域的安捷伦应用（5991-1504CHCN）。身份和异质性纯度和杂质效价技术指标ph溶解物的浓度外观液相色谱法电荷分布分子量一级结构高级结构糖基化的异质性蛋白质氨基酸的异质性通过c-端和截断型的鉴定进行异质性分析降解物、截断型、亚型脱酰胺基产物二聚体和多聚体翻译后修饰宿主细胞蛋白质相关蛋白质工艺相关杂质示例充分验证的生物效价测定蛋白质含量检测方法校正过的pH计参透压摩尔浓度颜色、澄清度和可见异物，目测HPLC，UHPLC，LC／MS，SEC离子交换色谱（IEC），等电聚焦（IEF）SEC，MS，SDS－PAGE通过Edman化学降解和HPLC测定肽图NMR，圆二色性用GC－MS或HPAEC－PAD和寡糖进行单糖组成分析用自动Edman化学降解和HPLC测定N－端序列结合肽图分析和ES－MS／MS进行C-端序列SDS－PAGE（还原性和非还原性）HPLC、UHPLC、LC/MS等电聚焦、IEC、肽图分析SEC、分析型超速离心、SDSPAGE基于肽图的二硫键分析，用合适的酶消化并用LC－EC/MS分析c－端序列分析SDS－PAGE、免疫分析SDS－PAGE、免疫分析、HPLC、LC/MS残留溶剂用GC顶空和GC－MS顶空测定：痕量金属用ICP－MS和ICP－DES测定效价UV扫描一般实验表1生物药品检验项目示例5二、色谱技术在生物大分子药物表征中的应用由于生物大分子药物的复杂性，在表征上综合使用生物学、物理学和物理化学以及化学等多种表征手段。以表1所列常见生物药品检验项目为例，这些检测项目包含了目前经常使用的主流方法。对于同一个技术指标，通常会有多种分析方法可供选择，比如电荷异质性可以使用离子交换色谱或/和等电聚焦毛细管电泳进行检测，不同的方法数据可以相互验证和补充。作为最广为使用的分离分析技术，色谱分析法是生物大分子药物表征不可或缺的方法。在蛋白类药物理化性质表征以及含量和杂质检查方面具有显著的优势，综合使用反相、离子交换、体积排阻、亲和等多种色谱模式从不同层面对生物大分子药物进行表征。进行信息整合，将“良好表征”的层次推向更高。与小分子药物色谱表征相比，生物药物表征采用的色谱分离模式更为广泛，小分子药物基本上以反相分离模式为主，而在生物药物表征除反相分离这种常用模式外还广泛使用离子交换、体积排阻以及亲水相互作用色谱模式。即使在反相分离这种模式中，生物药物分析也与小分子药物分析面临完全不同的挑战，采用了不一样的分析策略。在生物药物表征中，倾向于使用针对生物药物特点设计的专用柱，通常称之为生物色谱柱或简称生物柱。生物色谱柱是用于分离生物化合物，如多肽和蛋白质、寡核苷酸和多聚核苷酸，以及其他生物分子和复合物的液相色谱柱。生物柱是为生物分子分析而特别设计的。概括而言：1、生物药物分子量较大，色谱传质慢，需要具有适合大分子分析的大孔径和有利于传质的小粒径或核壳型填料。2、生物惰性填料，设计上尽量减少填料与分析物之间的非特异性结合，以提高回收率。3、氨基酸分析、肽图分析和糖谱分析均为多组分复杂体系分析，对分离度、重现性和通量有较高要求。在表征方法上，将还原法和整体法相结合。还原法的思路是将生物大分子分解为组成单元，如氨基酸、肽段、片段、糖等各种不同层次的组成部分，降低复杂程度，从而能精确地测定蛋白质的氨基酸组成、一级序列、翻译后修饰、二硫键连接以及糖基化等信息。整体法则是在保持蛋白分子完整性的前提下，通过蛋白分子在各种色谱模式下的保留和分离情况来表征蛋白分子的异质性和杂质。表2是以蛋白类药物为例，列出的常用色谱表征方法。针对特定的分析项目，对色谱柱性能还会有更为具体的要求，这在各论相关章节再做详细论述。在生物药物表征方面，‘完整解决方案’越来越受到重视，样品制备环节开始成为重要的制约因素之一，在氨基酸分析、肽图分析以及糖谱分析等项目上，往往都需要比较繁琐的衍生化和酶切过程。安捷伦注意到这一点，并努力开发样品前处理流程和试剂盒，确保方法的重现性和易操作性。三、如何使用本手册本手册不是一个产品手册或应用文集，也不是一个艰深的理论书籍。本手册更像一个以实用性为导向的标准操作程序（SOP），将一个分析流程按功能分成若干个模块，以肽图分析为例，整个流程被分为样品前处理、选择裂解试剂、变性还原和烷基化、酶解、酶解产物的纯化和富集、色谱柱选择、流动相选择、检测等多个模块，在各个模块中有常用起始条件和优化方法，以便操作者可以根据样品和分析目的进行