1.1基因工程基本工具

DNA重组技术的基本工具抗虫害的玉米转鱼抗寒基因的番茄转基因鲑鱼基因工程产品转黄瓜抗青枯病基因的甜椒乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷)基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程的别名基因拼接技术或DNA重组技术操作环境生物体外操作对象基因操作水平DNA分子水平基本过程剪切→拼接→导入→表达结果人类需要的基因产物想一想:获得转基因抗虫棉需要做哪些工作呢?基因工程培育抗虫棉的简要过程：普通棉花(无抗虫基因)苏云金芽孢杆菌提取抗虫基因与运载体DNA拼接导入棉花细胞(含抗虫基因)转基因棉花植株1）提取目的基因2）目的基因与载体结合3）将目的基因导入受体细胞4）目的基因的检测和表达基因工程操作的四个基本步骤上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？关键步骤1.ONE提取基因2.TWO基因与运载体DNA连接3.THREE基因导入棉花植株实现这一精确的操作过程的工具是什么呢?操作工具1.ONE提取基因2.TWO基因与运载体DNA连接3.THREE基因导入棉花植株限制性核酸内切酶DNA连接酶载体——“分子手术刀”——“分子缝合针”——“分子运输车分子手术刀------限制性核酸内切酶(限制酶)A.来源:主要从原核生物中分离纯化想一想:1.这类酶在原核生物中起什么作用?原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的限制酶是一类酶，不是一种酶B.作用:识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开.迄今为止，基因工程中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们各自可以识别和切断DNA上特定的碱基序列。细菌中限制酶之所以不切断自身DNA，是因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，对于外源入侵的DNA可以降解掉。生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。2.为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的DNA？迄今为止已经从近300中微生物中分离出约4000种限制酶限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4、5、8个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。C.识别序列的组成:大多数由六个核苷酸组成D.切割后产生的DNA片段末端的形式黏性末端平末端黏性末端黏性末端黏性末端：被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。什么叫平末端？平末端是如何形成的？当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，产生的是黏性末端。DNA连接酶------“分子缝合针”切断的DNA片段要与受体细胞的DNA连接，你觉得可以用什么酶？1、种类：两类E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶DNA连接酶——“分子缝合针”这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口，而不能连接单链DNA。E·coli连接酶只能连接黏性末端；T4连接酶既可“缝合”黏性末端，又可“缝合”平末端，但连接平末端之间的效率比较低.DNA连接酶——“分子缝合针”DNA连接酶与DNA聚合酶一样吗？为什么？DNA连接酶连接黏性末端之间的磷酸二酯键，形成重组的DNA分子。作用部位：磷酸二酯键不是一回事。DNA连接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二酯键（在相邻核苷酸的3位碳原子上的羟基与5位碳原子上所连磷酸基团的羟基之间形成），那么，二者的差别主要表现在什么地方呢？（1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。（2）DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板。此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。DNA连接酶DNA聚合酶连接DNA链双链单链连接部位在两DNA片段之间形成磷酸二酯键将单个核苷酸加到已存在的核酸片段的3’末端的羟基上，形成磷酸二酯键DNA聚合酶和DNA连接酶有何相同点和不同点？基因的载体——“分子运输车”载体必须具备的条件：1、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；2、具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接；3、具有某些标记基因，便于进行筛选。（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等）4、对受体细胞无害载体的作用：1、将外源基因转移到受体细胞中去。2、利用运载体在受体细胞内，对外源基因进行大量复制。常用的载体有：质粒，λ噬菌体的衍生物，动植物病毒等质粒质粒是基因工程最常用的运载体，它广泛地存在于细菌中，是细菌染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子，大小只有普通细菌拟核DNA的百分之一。要对天然质粒进行人工改造想一想:天然的DNA分子可以直接用作基因工程载体吗?DNA重组技术的基本工具1.手术刀(基因的剪刀)------准确切割DNA2.缝合针(基因的针线)-----将DNA片段再连接起来3.运输工具(基因的运载体)------将体外重组好的DNA导入受体细胞基础理论和技术的发展催生了基因工程DNA是遗传物质的证明DNA双螺旋结构和中心法则的确立遗传密码的破译基因转移载体的发现工具酶的发明DNA合成和测序技术的发明DNA体外重组的实现重组DNA表达实验的成功第一例转基因动物问世PCR技术的发明基础理论技术发明1.以下说法正确的是（）A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列B、质粒是基因工程中唯一的运载体C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接D、DNA连接酶使黏性末段的碱基之间形成氢键C练习2.不属于质粒被选为基因运载体的理由是A、能复制（）B、有多个限制酶切点C、具有标记基因D、它是环状DNAD练习3.有关基因工程的叙述中，错误的是（）A、基因工程技术能定向地改造生物的遗传性状，培育生物新品种B、重组DNA的形成在细胞内完成C、目的基因须由运载体导入受体细胞D、质粒都可作为运载体BD练习4、下列不适合用于基因工程的运载体是（）A、质粒B、噬菌体C、细菌D、病毒选我C5、下列说法正确的是：（）A、限制酶的切口一定是GAATTC碱基序列B、质粒是基因工程中唯一的运载体C、重组技术所用的工具酶是限制酶、连接酶、运载体D、利用运载体在宿主细胞内对目的基因进行大量复制的过程可称为“克隆”选我D审题6、下列黏性末端属于同种内切酶切割而成的是（）A、①②B、①③C、①④D、②③TCGAGCTTAAAGGTTCCAAGCTTCAGAATTCG③①②④7、下列哪一种酶是基因工程的工具酶（）A、DNA连接酶B、DNA酶C、RNA酶D、运载体选我AA记住了2和7能连接形成…ACGT……TGCA…；4和8能连接形成…GAATTC……CTTAAG…；3和6能连接形成…GCGC……CGCG…；1和5能连接形成…CTGCAG……GACGTC…。教材P7思考与探究12.提示：迄今为止，基因工程中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们各自可以识别和切断DNA上特定的碱基序列。细菌中限制酶之所以不切断自身DNA，是因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，对于外源入侵的DNA可以降解掉。生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵3.提示：基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒，即独立于细菌拟核处染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？其实不然，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件。（1）载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。（2）载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。（3）载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。（4）载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。（5）载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。基因操作的基本步骤提取目的基因从供体细胞的DNA中直接分离基因（如“鸟枪法”）人工合成基因反转录法化学合成法目的基因是人们所需要转移或改造的基因。如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。三种目的基因提取方法的优缺点仅限于合成核苷酸对较少的简单基因专一性最强化学合成法操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高专一性强反转录法工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因操作简便广泛使用鸟枪法缺点优点目的基因与运载体结合将目的基因导入受体细胞目的基因的检测和表达检测：通过检测标记基因的有无来判断目的基因是否导入。表达：通过特定性状的产生与否来确定目的基因是否表达。常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。基因操作的基本步骤目的基因导入受体细胞的方法1、将细菌用CaCl2处理，以增大细菌细胞壁的通透性。2、使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。3、目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。基因操作的基本步骤基因操作的基本步骤基因工程的成果与发展前景基因工程与医药卫生生产基因工程药品用于基因诊断与基因治疗基因工程与农牧业、食品工业培育高产、稳产和具有优良品质的动植物新品种培育具有各种抗逆性的动植物新品种为人类开辟新的食物来源基因工程与环境保护用于环境监测用于被污染环境的净化基因工程与医药卫生我国生产的部分基因工程疫苗和药物1、基因工程药品的生产微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。如利用大肠杆菌生产胰岛素、干扰素、白细胞介素—2等。既增加产量，又降低成本。基因工程与医药卫生2、基因诊断基因诊断是用放射性同位素(如32P)、荧光分子等标记的DNA分子做探针，利用DNA分子杂交原理，鉴定被检测标本上的遗传信息，达到检测疾病的目的。生物芯片从正常人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出标准图谱。从病人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出病变图谱。通过比较、分析这两种图谱，就可以得出病变的DNA信息。基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点，将成为一项现代化诊断新技术。基因工程与医药卫生3、基因治疗基因治疗是把健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的。取患者骨髓分离干细胞病毒正常基因并入正常基因的干细胞注入患者体内基因工程与农牧业、食品工业生长快、肉质好的转基因鱼