转基因食品的检测方法

转基因食品的检测方法普通大米(左）与黄金大米(右)的比较。黄金大米是一种转基因稻米品种，由美国先正达种子公司参与研发。非五颜六色的玉米！当香蕉遭遇转基因，太厉害了！转基因食品的安全性越来越受到广泛关注，虽然迄今为止尚未发现有证据表明转基因食品对健康和环境存在危害，但由于转基因食品安全性评价具有积累性和潜在性特点，并与社会、文化及伦理等多方面因素互为影响所以需要多方位长期系统的监测才能对其安全性做出较为客观的评价，其中转基因食品的检测技术尤为重要。对受检产品进行鉴定，区别转基因食品与非转基因食品，筛选出在遗传分化过程中已失去转基因特性的产品对受检产品中导入的基因重组体构成的变异情况进行检测检验针对外源DNA进行检测（核酸水平的检测）针对外源蛋白质进行检测（蛋白质水平的检测）主要采用1、核酸的提取2、定性筛选PCR技术3、实时荧光定量PCR法4、基因芯片检测法定量检测定性检测对于食品中转基因成分的核酸检测首先要进行核酸的提取，尤其是DNA的提取具有其特殊性。提取转基因相关食品中的DNA的2种方法：CTAB法SDS沉淀法CTAB法原理(植物DNA提取经典方法)CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。CTAB法实验流程SDS沉淀法原理SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55~65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸。提高盐（KAc或NH4AC）浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀。上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。注：SDS法适用于大部分实验材料基因组DNA提取。如动物组织、细胞、全血、细菌、酵母等。具有经济、简便的特点。SDS沉淀法实验流程（以动物组织为例）聚合酶链式反应（PCR)复合扩增PCR核酸印迹法聚合酶链式反应（PCR)聚合酶链式反应（PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火、适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA迅速扩展。具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。用于基因分离、克隆、核酸序列分析、疾病的诊断或任何有DNA、RNA的地方。注：每一次实验均需要设有阴性及阳性对照以确保实验结果可靠性。在样品采集及处理过程中也需要注意防止污染。1高温变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA2低温退火（55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。3.适温延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。注：Taq酶一种耐热的DNA聚合酶dNTP四种核苷酸，A、U、G、C的混合物复合扩增PCR复合扩增PCR是在同一反应管中含有一对以上引物，可以同时针对几个靶位点进行检测的PCR技术。该技术不仅效率高，而且因为它是针对多个靶位点进行同时检测，所以其检测效果较之普通PCR更为可信。核酸印迹法以放射性或荧光标记的外源目的基因的同源序列作为探针与该食品原料农产品的总DNA进行杂交。首先用限制酶消化受体总DNA，通过琼脂糖凝胶电泳按大小分离所得的片断，随后使DNA在原位发生变性，并从凝胶转移至一固相支持体上。DNA转移至固相支持体的过程中，各个DNA片断的相对位置保持不变，用放射性或荧光标记的探针与各个DNA片断杂交，经放射自显影确定与探针互补的电泳条带的位置。核酸印迹法技术用于食品外源基因的检测可检测出外源基因与内源基因有高度同源性的DNA片断，且准确可靠，但对样品的纯度要求较高，费用也较高。实时荧光定量PCR技术最早在1996年由美国AppliedBiosysyems公司推出，是指在常规PCR基础上添加了一条标记了两个荧光基团的探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量的方法。荧光探针主要有三种：分子信标探针、TaqMan探针、杂交双探针。灵敏度很高，对加工、未加工和样品都可进行检测。其实质就是高度集成化的反向斑点杂交技术。探针分子固定在载体上，待测基因经过PCR、末端标记等操作，完成标记有荧光染料或同位素的核酸分子，然后与固定的探针杂交。进行筛查、定性、定量，具有高通量、集成化和自动化的特点。我国开发的转基因产品检测芯片基本上能实现：确定是否是源基因食品、是哪一种源基因食品、是否是我国已批准的源基因食品。目前研制的芯片能检测国内外已批准商品化转基因作物物种：大豆、玉米、油菜、棉花、马铃薯、烟草、西红柿、木瓜、西葫芦、甜椒等。是一种高通量、针对待测核酸中靶序列进行定性和定量分析的新技术，它利用简单的杂合、连接、及PCR扩增反应，于单一反应管内可同时检测40个不同的核苷酸序列的拷贝数变化。广泛应用于基因检测、基因诊断等多个领域。灵敏度高、操作简便、高通量检测不用于单个细胞检测、不能检测染色体平衡易位酶联免疫吸附是一种酶联免疫技术。用于检测包被于固相板孔中的待测抗原（或抗体）即：用酶标记抗体并将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相载体表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，最后通过酶作用于底物后显色来判断结果。可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。ELISA分析法特异性高、操作简单、成本低、稳定性好，但如果食品中被检测蛋白浓度较低时会出现假阴性。该法只适用于原料性食品，难应用于加工品（因为外源基因表达的蛋白会因加工而失活、分解或消失）。蛋白质印迹法是一种分析和鉴定特定蛋白质的技术。将经过凝胶电泳分离的蛋白质转移到膜上，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分再对转移膜上的蛋白质进行检测的技术。该法将电泳较高的分离能力、抗体的特异性和放射性自显影的灵敏性结合起来，对分析不溶性蛋白有较好的效果。2、蛋白质印迹法(WesternBlotting)