酵母菌的分离纯化

酵母菌的分离纯化、固定化和酒精发酵第一部分酵母菌的分离纯化一、实验目的应用酵母菌的生理生化和生态学的特点，从自然环境中分离酵母菌，并掌握微生物分离纯化的基本方法。二、实验原理酵母菌常见于含糖份比较高的环境中，如果园土、菜园土及果皮等的表面。多数酵母菌喜欢偏酸条件，最适pH为4.5-6.0.酵母菌生长迅速，容易分离培养。在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长快，利用酸性条件则可以抑制细菌的生长。因此常用酸性液体培养基获得酵母菌的加富培养，然后在固体培养基上划线分离纯化。三、器材和用品1、甘蔗、苹果皮、葡萄皮、果园土、菜园土等。2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯200g（煮开10min后过滤取汁），葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，pH自然。分装三角瓶；试管斜面1支/组3、乳酸马铃薯葡萄糖培养液：配方同上，不加琼脂加乳酸，按1000ml培养基加入5ml乳酸，pH为5.5左右，再分装试管9ml2支/组。4、无菌吸管3支/组、无菌培养皿、100ml无菌水1瓶/组、涂棒、美兰染液、显微镜、接种环等。四、实验方法1、接种：取果皮（不需冲洗）或土壤5克，加入到100ml无菌水中，充分搅拌后，用无菌吸管取1ml接入到9ml乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28-3300℃℃培培养养箱箱中中培培养养2244hh，，可可见见培培养养液液变变浑浑浊浊。。22、、加加富富培培养养：：用用无无菌菌吸吸管管取取上上述述培培养养液液11mmll，，注注入入另另11管管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28-3300℃℃培培养养箱箱中中培培养养2244hh。。33、、镜镜检检：：用用无无菌菌操操作作法法用用接接种种环环取取少少量量菌菌液液置置于于载载玻玻片片上上，，中中央央滴滴一一滴滴美美兰兰染染液液，，混混合合均均匀匀后后制制成成水水浸浸片片，，在在高高倍倍镜镜下下观观察察酵酵母母菌菌的的形形态态及及出出芽芽方方式式，，并并可可根根据据菌菌体体是是否否染染色色来来区区分分酵酵母母菌菌的的死死活活细细胞胞，，因因活活细细胞胞使使美美兰兰染染液液还还原原，，故故菌菌体体不不着着色色。。44、、涂涂皿皿：：用用马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板，用无菌吸管取0.1ml加加富富培培养养液液到到平平板板中中，，用用涂涂棒棒涂涂匀匀后后培培养养2244hh。。55、、分分离离纯纯化化：：用接种环挑取单个酵母菌菌落，，在在平平板板上上四四区区划划线线，，培培养养后后分分离离得得到到单单个个菌菌落落。。66、、镜镜检检：：挑挑取取单单菌菌落落，，制制片片观观察察其其形形态态。。77、、菌菌种种保保藏藏：：接接种种酵酵母母菌菌到到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，长出菌苔后冰箱保藏。第二部分酵母菌的固定化技术一一、、实实验验目目的的11..了了解解固固定定化化细细胞胞的的原原理理。。22..掌掌握握用用海海藻藻酸酸钠钠制制备备固固定定化化酵酵母母细细胞胞的的方方法法。。二二、、实实验验原原理理固定化细胞技术是指用物理或化学的手段将游离细胞定位于限定的空间区域，并使其保持催化活性、反复使用的方法。优点：细胞密度高、反应速度快、耐毒害能力强、产物分离容易、可反复使用、能实现连续操作，可大大提高生产能力。用于生产各种胞外产物，包括酒精酒类、氨基酸、有机酸、酶、辅酶、抗生素。细细胞胞固固定定化化的的方方法法有有多多种种，，如如吸吸附附法法、、交交联联法法和和包包埋埋法法等等。。吸附法：又叫载体结合法，依据带电的微生物细胞和载体之间的静电、表面张力和黏附力的作用，使细胞固定在载体表面和内部；简便，活力损失小；但细胞与载体作用力小，易脱落。交联法：利用双功能或多功能试剂，直接与细胞表面的反应基团（如氨基酸、羟基、咪唑基等）发生反应，使其彼此交联形成网状结构的固定化细胞，其结合力是共价键。此法制备麻烦，活力损失较大；但细胞与载体结合较紧。包埋法：分为凝胶包埋法和半透膜包埋法。凝胶包埋法是将细胞包埋在各种凝胶内部的微孔中而使细胞固定；半透膜包埋法是将细胞包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内。简单，条件温和，稳定性好，包埋细胞容量高。工工业业上上常常用用包包埋埋法法固固定定微微生生物物细细胞胞。。海藻酸盐是一种广泛应用的固定化介质，具有化学稳定性好、无毒、包埋效率高且价格低廉等优点。在在海海藻藻酸酸钠钠呈呈溶溶液液状状时时，，将将细细胞胞加加入入混混匀匀，，然然后后在在氯氯化化钙钙中中凝凝固固形形成成海海藻藻酸酸钙钙凝凝胶胶，，凝凝胶胶颗颗粒粒中中的的微微小小空空格格将将细细胞胞固固定定。。海海藻藻酸酸钙钙凝凝固固的的颗颗粒粒能能反反复复使使用用，，细细胞胞在在空空格格中中可可以以新新陈陈代代谢谢（（固固定定活活细细胞胞))。。三三、、实实验验材材料料11、、分分离离的的酵酵母母菌菌。。22、、培培养养基基：：酵酵母母膏膏1100gg，，蛋蛋白白胨胨2200gg，，葡葡萄萄糖糖3300gg，，蒸蒸馏馏水水11000000mmLL，，ppHH自自然然，，111155℃℃灭灭菌菌2200mmiinn。。33、、试试剂剂：：00..22mmooll//LL氯氯化化钙钙溶溶液液115500mmll//瓶瓶（（2222..22gg氯氯化化钙钙，，蒸蒸馏馏水水11000000mmLL））、、22%%海海藻藻酸酸钠钠5500mmll//瓶瓶：：称称取取一一定定的的海海藻藻酸酸钠钠加加入入无无菌菌烧烧杯杯中中，，先先加加少少量量水水调调成成糊糊状状，，在在不不足足水水份份适适当当加加热热融融化化。。44、、器器具具：：220000mmll无无菌菌烧烧杯杯11个个、、玻玻璃璃棒棒11根根、、无无菌菌注注射射器器11个个（（2200mmll））、、无无菌菌吸吸管管11支支，，无无菌菌水水220000mmll//三三角角瓶瓶、、1100mmll培培养养基基试试管管11支支、、220000mmll三三角角瓶瓶培培养养基基11个个、、青青霉霉素素、、天天平平、、纱纱布布、、细细绳绳、、电电炉炉、、培培养养箱箱、、棉棉塞塞等等。。四四、、实实验验步步骤骤11、、将将酵酵母母菌菌接接入入1100mmll培培养养基基中中,,于于3300℃℃培培养养箱箱中中培培养养2244hh后后待待用用。。22、、取取33mmll酵酵母母菌菌培培养养液液（（预预热热到到3355℃℃左左右右））加加入入到到5500mmll22%%海海藻藻酸酸钠钠溶溶液液中中（（冷冷却却到到4455℃℃左左右右）），，均均匀匀混混合合后后用用注注射射器器吸吸入入制制成成小小球球滴滴入入115500mmll00..22mmooll//LL氯氯化化钙钙溶溶液液中中，，搅搅拌拌成成珠珠（（固固定定酵酵母母））。。33、、待待凝凝胶胶珠珠在在氯氯化化钙钙溶溶液液中中浸浸泡泡3300mmiinn后后，，用用蒸蒸馏馏水水洗洗涤涤固固定定酵酵母母22次次后后，，再再转转入入到到灭灭过过菌菌的的220000mmLL液液体体培培养养基基中中（（其其中中加加入入11mmgg青青霉霉素素））。。44、、将将固固定定酵酵母母于于2288℃℃静静置置培培养养33天天后后观观察察，，可可见见培培养养基基中中有有大大量量的的CCOO22气气泡泡产产生生，，嗅嗅气气味味有有酒酒香香；；用用刀刀片片切切开开固固定定酵酵母母，，镜镜检检可可见见大大量量密密集集的的酵酵母母菌菌。。第三部分酵母菌的酒精发酵一一、、实实验验目目的的11..掌掌握握酵酵母母菌菌生生产产酒酒精精的的方方法法。。22..了了解解酒酒精精发发酵酵的的主主要要类类型型及及其其控控制制条条件件。。二二、、实实验验原原理理在在厌厌氧氧条条件件下下，，己己糖糖分分解解为为乙乙醇醇并并放放出出二二氧氧化化碳碳的的作作用用，，称称为为酒酒精精发发酵酵作作用用。。酒酒精精发发酵酵的的类类型型有有三三种种：：即即通通过过EEMMPP途途径径的的酵酵母母菌菌酒酒精精发发酵酵、、通通过过HHMMPP途途径径的的细细菌菌酒酒精精发发酵酵（（即即异异型型乳乳酸酸发发酵酵））和和通通过过EEDD途途径径的的细细菌菌酒酒精精发发酵酵。。在在工工业业酒酒精精和和各各种种酒酒类类的的生生产产中中，，酒酒精精发发酵酵的的主主要要作作用用是是由由酵酵母母菌菌来来完完成成的的。。酵酵母母菌菌通通过过EEMMPP途途径径分分解解己己糖糖生生成成丙丙酮酮酸酸，，在在厌厌氧氧和和微微酸酸性性条条件件下下，，丙丙酮酮酸酸继继续续分分解解为为乙乙醇醇。。但但是是，，如如果果在在碱碱性性条条件件下下或或在在培培养养基基中中加加入入亚亚硫硫酸酸盐盐时时，，产产物物主主要要是是甘甘油油，，这这就就是是工工业业上上的的甘甘油油发发酵酵。。因因此此，，如如果果酵酵母母菌菌要要进进行行酒酒精精发发酵酵，，就就必必须须控控制制发发酵酵液液在在微微酸酸性性条条件件下下。。三三、、实实验验材材料料11、、菌菌种种：：分分离离的的酵酵母母菌菌。。22、、培培养养基基：：白糖（蔗糖）80g、(NH4)2SO42.0g、KH2PO41.0g、H2O1000ml；pH自然，111155℃℃灭灭菌菌2200mmiinn。。115500mmll三三角角瓶瓶装装上上述述培培养养基基5500mmll，，225500mmll三三角角瓶瓶装装培培养养基基110000mmll，，大大试试管管中中装装一一个个注注满满培培养养基基的的杜杜氏氏小小管管，，再再装装入入1100mmll培培养养基基。。33、、试试剂剂：：10%的NaOH、10%H2SO4、1%K2Cr2O7。44、、器器材材：：115500mmll三三角角瓶瓶11个个、、225500mmll三三角角瓶瓶11个个、、大大试试管管11支支、、杜杜氏氏小小管管11支支、、无无菌菌吸吸管管11支支。。接接种种环环、、培培养养箱箱、、110000mmLL量量筒筒、、纱纱布布、、细细绳绳、、天天平平、、棉棉塞塞33个个。。四四、、实实验验步步骤骤11、、取取分分离离的的酵酵母母菌菌种种一一环环，，接接入入115500mmll的的三三角角瓶瓶中中，，于于2288--3300℃℃培培养养箱箱中中培培养养2244hh，，作作为为液液体体种种子子。。将将上上述述液液体体种种子子以以55%的接种量分别接入250ml的三角瓶和大试管中，在于于2288--3300℃℃培培养养箱箱中中培培养养2244--3366hh，，后后观观察察结结果果。。22、、二二氧氧化化碳碳生生成成的的检检验验11））观观察察三三角角瓶瓶中中的的发发酵酵液液有有无无泡泡沫沫或或气气泡泡溢溢出出，，再再观观察察发发酵酵试试管管中中的的杜杜氏氏小小管管中中有有无无气气体体聚聚集集。。22））取取10%的NaOH溶液1ml注入发酵试管内，轻轻搓动发酵管，观察杜杜氏氏小小管管内内液液面面是是否否上上升升，，如如气气体体逐逐渐渐消消失失，，则则证证明明气气体体为为发发酵酵过过程程中中产产生生的的二二氧氧化化碳碳。。3、酒精生成的检验：1）打开发酵瓶塞子，嗅闻有无酒精味；2）取发酵液5ml加入试管，加10%H2SO4溶液2ml；向试管中滴入1%K2Cr2O7溶液10～20滴；如管内由橙黄色变为黄绿色，证明有酒精生成。2K2Cr2O7+8H2SO4+3CH3CH2OH→3CH3COOH+2K2SO4+2Cr2(SO4)3(黄绿色)+11H2O实实验验报报告告：：11、、酵酵母母菌菌的的形形态态以以及及增增殖殖方方式式？？怎怎样样判判断断酵酵母母菌菌的的死死活活细细胞胞？？22、、海海藻藻酸酸钠钠溶溶液液滴滴进进氯氯化化钙钙溶溶液液中中为为什什么么会会凝凝固固？？33、、细胞固定化有何意义？如何制备固定化细胞？4、固固定定化化细细胞胞与与游游离离细细胞胞比比较较，，有有什什么么优优点点？？5、固定化细胞制备过程中观察到的现象？6、酒精发酵过程中观察到的现象？