2015年版中国药典微生物限度检查法

微生物限度检查法《中国药典》2015年版修订后将分为三个附录：–1、非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法–2、非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法–3、非无菌药品微生物限度标准1.1总则：环境、要求1.2计数方法：平皿法、薄膜过滤法、最可能数法（MPN法）1.3计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验：菌种及菌液制备、培养基适用性检查、计数方法适用性试验。1.4供试品检查：检验量、供试品检查1.5结果判断1.6稀释液、冲洗液及培养基1.非无菌产品微生物限度检查：----微生物计数法•微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。•当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时，应按规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。•本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法，但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法。1.1总则：1.1总则：•环境：–微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。(在不低于GMP现行版要求的D级洁净环境、局部洁净度不低于B级的单向流空气区域内进行)【10版：在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内】。–检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。–单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。1.1总则：•如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。供试品检查时,若使用了中和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。•供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。•平皿法•薄膜过滤法•最可能数法（Most-Probable-NumberMethod，简称MPN法）。–MPN法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，MPN法可能是更适合的方法。•供试品检查时,应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，所选的方法必须具备检测充足样品量的能力，以保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。所选方法的适用性须经确认。1.2计数方法：•供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。•供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验【10版：方法验证】，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。•若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。1.3计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验•1.3.1菌液制备及使用•1.3.2计数培养基适用性检查•1.3.3计数方法适用性试验1.3计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验•1.3.1菌液制备及使用–菌种•试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。1.3计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。稳定的黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。1.3.1菌液制备及使用试验菌株试验菌液的制备金黄色葡萄球菌〔CMCC(B)26003)〕胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基【10版：营养肉汤或营养琼脂培养基】30～35℃，18～24小时铜绿假单胞菌〔CMCC（B)10104〕枯草芽孢杆菌〔CMCC(B)63501〕白色念珠菌〔CMCC(F)98001〕沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基，20～25℃，2～3天【10版：改良马丁（琼脂）培养基，23~28℃，24~48h】黑曲霉〔CMCC(F)98003〕沙氏葡萄糖琼脂培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基，20～25℃，5～7天，或直接获得丰富孢子【10版：改良马丁琼脂斜面培养基，23~28℃，5~7天】1.3.2计数培养基适用性检查【10版】细菌计数金黄色葡萄球菌营养琼脂培养基30～35℃不超过3天铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌霉菌及酵母菌计数白色念珠菌玫瑰红钠琼脂培养基20～25℃不超过5天黑曲霉每一试验菌株平行制备2管或2个平皿；接种量50~100cfu；同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。结果判定：若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的70%，且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。1.3.2计数培养基适用性检查【15版】需氧菌总数计数金黄色葡萄球菌胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基30～35℃不超过3天铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌胰酪大豆胨琼脂培养基30～35℃不超过5天黑曲霉霉菌和酵母菌总数计数白色念珠菌沙氏葡萄糖琼脂培养基20～25℃不超过5天黑曲霉每一试验菌株平行制备2管或2个平皿；接种量不大于100cfu；同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。结果判定：被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5-2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好。1.3.3计数方法适用性试验1.供试液制备2.接种和稀释3.抗菌活性的去除与灭活4.供试品中微生物的回收–平皿法–薄膜过滤法–最可能数法（MPN法）5.结果判断•1.4.1检验量–检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml或cm²）。–除另有规定外,一般供试品的检验量为10g或10ml；膜剂为100cm²；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。检验时,应从2个以上最小包装单位中抽取供试品,大蜜丸还不得少于4丸,膜剂还不得少于4片。–一般应随机抽取供试品，取规定容器数，混合，取规定量供试品进行检验。1.4供试品检查•按计数方法适用性试验确认的计数方法进行供试品中需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定。•胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基用于测定需氧菌总数；•沙氏葡萄糖琼脂培养基用于测定霉菌和酵母菌总数。•阴性对照试验–以稀释剂代替供试液进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。如果阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。1.4.2供试品检查•供试液制备–根据供试品的理化特性与生物学特性,采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需加温时,应均匀加热,且温度不应超过45℃。供试液从制备至加入检验用培养基,不得超过1小时。–常用的供试液制备方法如下。如果下列供试液制备方法经确认均不适用，应建立其他适宜的方法。1.4.2供试品检查•供试液制备–⑴水溶性供试品•取供试品，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7.2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1:10供试液。若需要，调节供试液pH值至6～8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。1.4.2供试品检查1.4.2供试品检查•供试液制备–⑵水不溶性非油脂类供试品•取供试品，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7.2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基制备成1:10供试液。分散力较差的供试品，可在稀释液中加入表面活性剂如0.1%的聚山梨酯80，使供试品分散均匀。若需要，调节供试液pH值至6～8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。1.4.2供试品检查•供试液制备–⑶油脂类供试品•取供试品，加入无菌十四烷酸异丙酯使溶解，或与最少量并能使供试品乳化的无菌聚山梨酯80或其他无抑菌性的无菌表面活性剂充分混匀。表面活性剂的温度一般不超过40℃（特殊情况下，最多不超过45℃），小心混合，若需要可在水浴中进行，然后加入预热的稀释液使成1∶10供试液，保温，混合，并在最短时间内形成乳状液。必要时，用稀释液或含上述表面活性剂的稀释液进一步10倍系列稀释。1.4.2供试品检查•供试液制备–⑷需用特殊方法制备供试液的供试品•膜剂供试品•肠溶及结肠溶制剂供试品•气雾剂、喷雾剂供试品•贴膏剂供试品1.平皿法–平皿法包括倾注法和涂布法。–除另有规定外，取规定量供试品，按方法适用性试验确认的方法进行供试液制备和菌数测定，每稀释级每种培养基至少制备2个平皿。–培养和计数除另有规定外，胰酪大豆胨琼脂培养基平板在30～35℃培养3~5天，沙氏葡萄糖琼脂培养基平板在20～25℃培养5~7天，观察菌落生长情况,点计平板上生长的所有菌落数，必要时可适当延长培养时间至7天进行菌落计数并报告。菌落蔓延生长成片的平皿不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。–若同稀释级两个平皿的菌落数平均值不小于15，则两个平皿的菌落数不能相差1倍或以上。1.4.2供试品检查菌数报告规则–需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于300cfu的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜选取平均菌落数小于100cfu的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。取最高的平均菌落数，计算1g、1ml或10cm²供试品中所含的微生物数。–如各稀释级的平皿均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以﹤1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。2.薄膜过滤法–除另有规定外，按计数方法适用性试验确认的方法进行供试液制备。取相当于1g、1ml或10cm²供试品的供试液，若供试品所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液，照方法适用性试验确认的方法加至适量稀释液中，立即过滤，冲洗，冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基上培养。–培养和计数培养条件和计数方法同平皿计数法，每张滤膜上的菌落数应不超过100cfu。•菌数报告规则–以相当于1g、1ml或10cm2供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以﹤1报告菌数（每张滤膜过滤1g、1ml或10cm2供试品）,或﹤1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。3.MPN法–取规定量供试品，按方法适用性试验确认的方法进行供试液制备和供试品接种，所有试验管在30～35℃培养3～5天，如果需要确认是否有微生物生长，按方法适应性试验确定的方法进行。记录每一稀释级微生物生长的管数，从表3查对每1g或1ml供试品中需氧菌总数的最可能数。1.5结果判断•需氧菌总数是指胰酪大豆胨琼脂培养基上生长的总菌落数（包括真菌菌落数）；•霉菌和酵母菌总数是指沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的总菌落数（包括细菌菌落数）。•若因沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的细菌使霉菌和酵母菌的计数结果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素（如氯霉素、庆大霉素）的沙氏葡萄糖琼脂培养基或其他选择性培养基（如玫瑰红钠琼脂培养基）进行霉菌和酵母菌总数测定。•使用选择性培养基时，应进行培养基适用性检查。若采用MPN法，测定结果为需氧菌总数。•各品种项下规定的微生物限度标准解释如下：–101cfu：可接受的最大菌数为20；–102cfu：可接受的最大菌数为200；–103cfu：可接受的最大菌数为2000：依此类推。•若供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的检查结果均符合该品种项下的规定，判供试品符合规定；若其中任何一项不符合该品种项下的规定，判供试品不符合规定。1.5结果判断2.1总则：环境、要求2.2培养基适用性检查和控制菌检查方法适用性试验：菌种及菌液制备、培养基适用性检查、控制菌检查方法适用性试验、2.3供试品检查：阴性对照试验、阳性对照试验、耐胆盐革兰阴性菌、大肠埃希菌、沙门菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌、白色念珠菌2.4稀释液2.非无菌产品微生物限度检查：----控制菌检查法2.1总则•控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物。•当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料是否符合相应的微生物限度标准时，应按下列规定进行检验，包括样品取样量和结果判断等。•本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法，但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法。•供试液制备及实验环境要求同“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”（通则1105）。•如果供试品具有抗菌活性，应尽可