典型水稻土中固碳基因及功能微生物研究

硕士学位论文典型水稻土中固碳基因及功能微生物研究作者姓名：肖可青指导教师:朱永官研究员中国科学院生态环境研究中心学位类别:理学硕士学科专业:环境科学培养单位:中国科学院生态环境研究中心2014年5月GeneticcharacterizationofmicrobialCO2fixationintypicalpaddysoilByKe-QingXiaoADissertationSubmittedtoUniversityofChineseAcademyofSciencesInpartialfulfillmentoftherequirementForthedegreeofMasterofNaturalScienceResearchCenterforEco-EnvironmentalSciences,ChineseAcademyofSciencesMay,2014独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：___________________日期：_________________关于论文使用授权的说明本人完全了解中国科学院生态环境研究中心有关保留、使用学位论文的规定，即：中国科学院生态环境研究中心有权保留送交论文及复印件，允许论文被查阅和借阅；可以公布论文的全部或部分内容，可以采用复制或其他手段保存论文。（保密的论文在解密后应遵守此规定）签名：导师签名：日期：致谢I致谢光阴如梭，三年科院求学之旅，转眼即将逝去。三年前，在获得了研究生免试推荐资格后，怀着对科学研究的热爱，我毅然选择了中科院这片科研热土，不仅因为她大师辈出的历史与现实，更向往这里务实进取的良好氛围。科院的培养制度一方面使我们能在第一年全身心进行课程学习扎实掌握理论知识，另一方面相比从第一年就可以进入实验室做实验的高校同学，我们却少了近一年的时间，无形中增加了论文和毕业的压力。如今能顺利申请毕业答辩，我要首先感谢我的导师朱永官研究员。本论文是在导师朱永官研究员的悉心指导下完成的，从论文选题、试验设计、结果分析到论文写作的各个环节都倾注了恩师的心血与教导。恩师渊博的知识，严谨的治学态度，忘我的工作精神，活跃的学术思维，雷厉风行的做事风格，高尚的人格和宽广的胸怀，使我受益匪浅。值此论文完成之际，在此谨向恩师表达最诚挚的感谢与祝福！衷心感谢贺纪正老师、黄益宗老师、乔敏老师、胡莹老师、刘云霞老师、孙国新老师、段桂兰老师、陈正老师、张丽梅老师、郑袁明老师和刘玉荣老师的帮助与指导！衷心感谢中科院城市环境研究所的苏建强老师、亚热带所魏文学老师和葛体达老师在样品采集、实验过程和数据分析方面的悉心指导。衷心感谢生态中心人教处的杜向荣老师、任慧敏老师、冯娟老师和曹青老师在入学和毕业过程中所给予的无私帮助。特别感谢尹西翔师兄、鲍鹏师兄、贾炎师兄、王凤花师姐、保琼莉师姐、王培培师姐、丁龙君师姐和张思宇师姐的无私帮助，使我在实验的各个过程中能够快速入门；衷心感谢聂三安师兄、李虎师兄和黄福义等对我实验的大力帮助；衷心感谢黄海、王光鹏、刘欣、梁建宏、张轩、伍文、降光宇、孙晓铧、张偲、徐峰、王斐、解惠婷、孙芬芬、王珊、周雪、王亚洁、李季、向猛、刘心等兄弟姐妹在实验上的帮助和生活上的照顾。你们乐观开朗的生活态度和孜孜不倦的求学精神一直感染着我，三年的美好时光我将终生难忘。衷心感谢众多朋友的关心，在你们的帮助和陪伴下我度过了三年快乐而充实的时光。最后要感谢我的家人在我求学过程中给予的无私奉献和始终如一的鼓励！是你们叮嘱和支持让我不敢懈怠，能够始终积极面对人生。最后感谢国家自然科学基金项目（No.41090280，No.41090282）对我硕士论文工作的支持！肖可青2014年5月摘要II摘要陆地生态系统是地球上仅次于海洋生态系统的第二大碳（C）库。农田土壤是陆地生态系统的重要组成部分，由于人类活动的长期干扰（如耕作、施肥、排水和灌溉等）使得该C库成为最活跃的一部分，而这一特征在水稻土中尤为明显。微生物在C元素循环过程中扮演中极为重要的作用，它们有极高的丰度和代谢多样性，几乎参与了C循环的所有环节。由微生物调控的土壤C循环过程可以固定或释放温室效应气体CO2，进而影响全球气候。研究微生物固定CO2的分子生态机理对于缓解全球气候变暖具有重要科学意义，同时也可以为农田土壤肥力科学化管理提供技术支撑，为正确评估农田土壤固碳潜力及低碳农业规划提供科学依据。至今已发现的微生物固定CO2途径有5条，即Calvin循环、还原性三羧酸循环（rTCA）、还原性乙酰辅酶A途径、3-羟基丙酸盐/苹果酰-辅酶A循环和4-羟基丁酸盐循环，其中Calvin循环途径是公认的主要的微生物固碳途径。在这些生化途径中，催化关键反应步骤的酶常被认为是关键酶，其对应的编码基因常用作marker基因，在微生物生态学研究中广泛应用于功能微生物的定量和系统进化分析。然而，综合文献我们发现，目前的研究多集中于水生生态系统和旱地，对于水稻土中的微生物固碳过程关注较少，而且对于除Calvin循环以外的其他固碳途径研究也比较缺乏。基于此，本研究利用酶活测定、实时定量PCR（qPCR）、末端限制性长度多态性分析（T-RFLP）、克隆和测序等多种生物学技术，收集我国南方五种典型水稻土，对其中通过Calvin循环进行自养固碳的微生物进行了原位研究；其次选取其中两种不同类型的水稻土进行室内模拟实验，采用根袋区分和收集根际与非根际土壤，进行氮肥处理，并在不同的水稻生长期采样，重点考察根际效应对微生物固碳过程的影响。结合土壤理化性质测定和统计分析，探究影响微生物固碳过程的关键环境因子及其贡献。论文主要的研究内容与成果如下：1.原位土壤研究对我国南方五种典型水稻土中通过Calvin循环进行自养固碳的微生物进行原位研究。利用酶活性测定、qPCR、克隆文库以及T-RFLP方法结合土壤理化性质分析研究发现：Calvin循环途径的3种marker基因中，cbbLG多样性最低，且序列多和硫杆菌属的一些细菌相似度较高；与此对应，cbbLR和cbbM基因具有很高的多样性，其序列大多独立成簇，不能归类到已知的细菌类群中。qPCR结果显示3种基因丰度范围在在106-109拷贝数/克干土，并且cbbLR的丰度均典型水稻土中微生物固碳研究III高于cbbM和cbbLG，且其丰度与土壤固碳酶活性显著正相关，我们推测cbbLR在3种基因中可能发挥着更大的作用。与土壤理化性质进行统计分析显示粘粒含量、碳氮比、阳离子交换量（CEC）、pH和土壤有机碳（SOC）含量对微生物群落组成和marker基因丰度变异显著相关。2.微宇宙实验选取其中两种不同类型的水稻土进行室内模拟实验，采用根袋区分和收集根际与非根际土壤，进行氮肥处理，并在不同的水稻生长期采样，重点考察根际效应对微生物固碳过程的影响。利用qPCR揭示了3种自养固碳途径的marker基因在水稻不同生长阶段在根际与非根际土壤中的变化与多样性。基于偏冗余分析（pRDA）的变量分离研究显示生长期、土壤类型和根际效应与基因丰度变异均显著相关（P0.05），分别贡献了37%，19%和12%的解释量，而氮处理（尿素添加）则没有显著贡献（P＞0.05）。结果表明不同环境因素对土壤固炭基因丰度变异影响顺序为：生长周期＞土壤类型＞根际效应。可以说，水稻土中固定CO2的自养微生物受多种环境因素及其相互作用共同影响。以上研究表明，水稻土具有很大的微生物固碳潜力。Calvin循环的3个marker基因中，cbbLR基因由于其高丰度可能比另外两个基因发挥更重要的作用，而环境因子如CEC、pH、粘粒含量、C/N和SOC等对基因多样性有显著影响。自养固碳途径的marker基因在水稻不同生长阶段在根际与非根际土壤中的变化与多样性。而生长周期和土壤类型对这些基因丰度的变异影响更大，而根际效应贡献相对较少。因此水稻土微生物固碳受多种环境因素及其相互作用共同影响。本研究部分揭示了水稻土中微生物固碳分子生态机理，对于理解微生物在全球气C循环过程中的作用具有一定科学意义，也可以为农田土壤肥力科学化管理和构建低碳农业提供科学依据。关键词：水稻土，微生物固碳，marker基因，环境因子，根际效应ABSTRACTIVABSTRACTTerrestrialecosystemisthesecondlargestcarbon(C)poolontheearth.Agriculturallandisanimportantpartofterrestrialecosystem,andthereinCpoolisthemostactivepartunderfrequenthumandisturbance(tillage,fertilization,drainage,andirrigation),especiallyforpaddysoils.MicroorganismsplayanimportantroleintheCturnover,astheyareinvolvedinalmostallprocessesofthecarboncycleduetotheirhighabundanceanddiversemetabolicpathways.TheturnoverofCduringsoilbiomassformationanddecompositionmediatedbymicroorganismsleadstothereleaseorsequestrationofgreenhousegasCO2,affectingglobalwarmingpotentially.Therefore,researchonthisprocessisofgreatsignificanceformitigatingglobalwarming,andalsoforscientificfertilizationinagricultureandestablishinglow-carbonagriculture.Overthepast60years,fiveCO2fixationpathwayshavebeenfoundsuccessively:theCalvincycle,thereductivetricarboxylicacid(rTCA)cycle,thereductiveacetyl-CoApathway,the3-hydroxypropionate/malyl-CoAcycleandthe4-hydroxybutyratecycle.Amongthem,theCalvincycleisknowntobethemajorpathwayformicrobialCO2fixation.Theenzymescatalyzingmechanisticallydifficultstepsinagivenpathwayareusuallyconservedandactaskeyenzymes;thecorrespondingcodinggenes,oftennamedasmarkergenes,areubiquitouslyusedinmicrobialecologicalstudies.However,todata,previousstudieshaveemphasizedeitheruplandsoilsoraquaticenvironment,andalsopaidlittleattentiontootherpathwaysapartfromtheCalvincycle.Therefore,inthisstudy,clonelibrary,T-RFLP,qPCR,andenzymeassaywereusedtoinvestigatethreemarkergenesinvol