RNAi-技术

RNAi技术及其在植物中的应用汇报人：莫呈鹏小组成员：陈悦、田云恒、杨加亮CONTENTS01RNAi技术概述02RNAi技术在植物中的应用03RNAi技术应用的局限及展望1RNAi技术概述RNAi技术简介RNA干扰(RNAinterference,RNAi),是指外源或内源性双链RNA(dsRNA)在细胞内特异性地诱导与其同源互补的mRNA降解,促使其相应的基因表达关闭,继而引发基因沉默的现象。RNAi由长度为20-30nt的sncRNA（Smallnon-codingRNA）触发，根据sncRNA生物合成和作用机制的不同，可将其分为siRNA（smallinterferingRNA）、miRNA（microRNA）和piRNA（PIWI-interactingRNA）3种。PereiraP,QueirozJA,FigueirasA,etal.AffinityapproachesinRNAi-basedtherapeuticspurification［J］.JournalofChromatographyB,2016,1021（10）：45-56.RNAi作用机制siRNA1转录水平上的基因沉默miRNA2翻译水平上的基因沉默piRNA3siRNA的结构和功能存在相关性双链RNA经过切割形成20～25nt的siRNA,它们具有5′末端磷酸基,3′末端羟基和2个突出的单链核苷酸。平末端的siRNA或失去5′磷酸基团的siRNA不具有RNA干扰的功能。特异性导入到生物体内的siRNA仅能引起同源基因表达的抑制,而无关的基因不受影响,并且siRNA序列中配对的19～21nt中,如果只改变1个核苷酸,就可以使siRNA序列对靶mRNA不起作用高效性双链RNA在Dicer酶催化下形成siRNA,siRNA解链后一种是直接靶向结合mRNA,另一种是解链后与RISC形成复合物,这些RISC可以专一性地与靶向的mRNA特异性结合。RNAi技术特点扩散性沉默信号可以沿其同原序列的DNA向该目的基因的非同源区域扩散;或者指沉默信号从一个已经发生沉默的细胞内转到新的细胞里沉默信号可以沿其同原序列的DNA向该目的基因的非同源区域扩散;或者指沉默信号从一个已经发生沉默的细胞内转到新的细胞里。可遗传性在秀丽新小杆线虫、果蝇和小鼠的试验中可以看到,细胞增殖到50～100倍时仍可保持RNAi效应。不对称性RISC在装配过程中的不对称性,在RNAi作用中有一个关键的步骤,就是RISC的装配,RISC可以调控目标RNA的降解。然而,siRNA的2条链并不都能组装成RISC复合体,这取决于siRNA2条链5′端碱基对所具有的特点。RNAi技术特点1RNA干扰载体构建方法酶切-连接234零背景筛选Gateway技术人工miRNA酶切-连接1通过PCR方法得到目的基因的片段（添加了合适的酶切位点），使之正反相连形成顺式片段和反式片段，然后在顺反式片段之间插入一段中间间隔序列以增强基因沉默效果，最后将表达载体和RNA干扰片段相连接，形成可用于遗传转化的RNA干扰表达载体。优点缺点对于在载体上添加1到2个基因比较容易1.添加多个基因的表达载体比较困难2.周期比较长，至少需要3个“酶切—连接”的循环才能完成载体构建，耗时耗力3.对原始载体和目的片段的限制条件比较多，原始载体至少有4个可用酶切位点零背景筛选2优点缺点1.阳性重组子的筛选效率高2.只需一步酶切-连接过程即可以将干扰构件连接于载体上，构建成RNA干扰表达载体对原载体上可用酶切位点的要求低需要保真性高的DNA聚合酶Gateway技术3优点缺点1.耗时短、操作简单只需通过高效的BP和LR反应就可实现把目的基因定向转入表达载体中。2.成功率高，克隆效率可达到95％特殊载体，价格高人工miRNA4人工miRNA技术指利用miRNA的表达特性，使用生物体内源的miRNA前体作为人工miRNA的表达框架，产生出小分子RNA介导的靶基因沉默。因此，在二级结构不变的前提下，可以通过改变生物体内源miRNA前体的一些核苷酸，生成针对特异目的基因沉默的人工miRNA。优点缺点1.人工miRNA可以同时干涉多个序列具有同源性的基因2.具有干扰成功率高、并且允许碱基错配、允许同时表达几个人工miRNA分子，具有组织特异性存在临时性和不完全敲除的缺点2RNAi技术在植物中的应用LOREMIPSUM在基因功能研究中的应用LOREM1植物抗病研究中的应用LOREM2植物营养学研究中的应用LOREM3果实保鲜研究中的应用LOREM4RNAi技术在植物中的应用在基因功能研究中的应用LOREM1在基因组功能分析上,RNAi技术比突变策略具有更多的优势,尤其表现在是对所选的靶基因进行功能分析上。RNAi的特征是一种依赖性同源过程:特异性地选择目标基因上的单一序列进行降解就可以使这个基因家族中的单一成员发生沉默,或者也可利用同一家族的多个基因具有一段同源性很高的保守区域这一特点,设计针对这一段区域的双链RNA分子,将其导入便可产生多个基因同时被沉默的现象。选择RNAi的同时,随机性也就没有限制了。利用RNAi技术也可以去分析一些特定基因的功能。此技术解决了很多以往难以解决的问题。植物抗病研究中的应用LOREM2线虫病害给世界农业每年带来将近1250亿美元的损失。转基因植株在体内表达寄生线虫特异靶基因的dsRNA,寄生线虫摄取植物细胞质时会将这些dsRNA或者siRNA也摄取到体内。当dsRNA或siRNA进入到线虫体内时,线虫自身RNAi机制将使线虫体内靶基因沉默,继而影响寄生线虫的表型,达到抗线虫的目的。一些病毒病害的防治也可通过病毒诱导的基因沉默,而使植物达到抗病的作用。植物营养学研究中的应用LOREM3利用生物技术改良作物,使得作物某一对人类健康有益物质的含量提高,是非常必要的。其中采用RNAi技术就可以达到这样的目的。番茄中含有的类胡萝卜素和黄酮醇,二者是人体所必需的营养物质。通过使用RNAi干扰控制果实特异性启动子来抑制DET1,以此提高番茄中这2种营养物质的含量。试验结果表明,在转基因植株中RNAi能够非常有效地降解DET1转录体,继而明显提高了类胡萝卜素和黄酮醇的含量,果实内其他的营养价值并未受到影响。果实保鲜研究中的应用LOREM4植物果实的品质主要包括营养价值、果实的味道、加工的质量和果实的货架期。基因工程技术是防止植物果实腐败的最有效方法之一。植物果实成熟的过程中,由乙烯诱发的信号级联和相关基因参与共同调控植物果实的成熟,以致果实腐烂变质。植物中含有氨基环丙烷(ACC)氧化酶,它可以使ACC氧化为乙烯,由于乙烯在蔬菜水果成熟的过程中起到非常重要的调节作用,所以利用RNA干扰技术对ACC氧化酶进行调节,继而可以调节水果蔬菜的成熟期和储存时间。3RNAi技术应用的局限及展望LOREMIPSUM应用的局限•RNAi不能作用于所有基因和某些细胞类型(如神经元)，而且存在位置效应、临时性和不完全敲除的缺点，因此，RNAi不能完全替代基因敲除技，还需要更多新的基因编辑技术来实现基因敲除•由于RNAi技术主要应用在胞质中，有些核转录本，如长链非编码RNA(longnon-codingRNA,lncRNA)，就很难被作为目标。•siRNA不仅可与靶基因特异性结合，也可与非靶基因结合使其基因沉默，出现脱靶效应。前景展望•RNAi作为一项新兴的，其发展仅数年时间，大多数研究是在细胞水平进行，其抗病毒效应尚未在动物试验中得到进一步证实，RNAi技术对整个生物体的影响仍不明确，对作用于不同靶位RNAi的效应存在差异的机制、RNAi技术的安全性等仍有待进一步深入研究。•随着基因组测序及功能基因数目越来越多地被解析,RNAi机制研究的不断深入,人们将能够更好地认识植物生长发育规律的分子基础,利用RNAi技术调控植物中目的基因表达水平,最终人为控制植物各种性状,改良植物资源,从而让植物更好地为人类服务。