2013临床PCR检测技术-实习生讲课

临床PCR技术KaryB.MullisUSA,forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method1930年提出了两种核酸DNA和RNA的概念1953年Watson和Crick提出了DNA双螺旋结构及其半保留复制模型。一、PCR概述一、PCR概述（一）PCR概念PCR（polymerasechainreaction)是一种在体外通过重复DNA合成，以扩增特定核苷酸序列的方法。特点高灵敏度高特异性体外进行快捷PCR的概念核心技术是从水栖高温菌中分离到能耐高温的Taq酶，使扩增反应不需要每一个循环加一次DNA聚合酶，从而实现了自动化。应用领域迅速扩大，PCR技术成为了分子生物学中的一项突破性技术。PCR概述——2000至2013年发表论文1280748篇32%38%30%PCR＋遗传分析PCR＋临床诊断PCR＋肿瘤研究一、PCR概述（二）原理双链DNA变性退火链延伸（膜板）（双链分成单链）（膜板与引物杂交）（DNA合成）不断重复二、实验步骤（一）核酸提取1.DNA提取100ul浓缩液100ul血清吹打混匀12000g离心5min弃上清20ul提取液100℃煮10min模板二、实验步骤2.RNA提取10ulA液200ulB液震荡混匀8000g离心1min200ulDEPC乙醇65℃干燥10minRNA模板8000g离心1min逆转录为cDNA弃上清重复洗2次50ul血清3、细胞或组织剧烈震荡400ul试剂1加入400ul试剂2震荡混匀12000g离心5min完全弃上清加入试剂3模板加样扩增杂交显色（二）扩增HBV引物(168bp)：上游：5-GAAGTGTGACGTTGACATCC下游：5-ACAGAGTACTTGCGCTCAGG扩增体系：（50μl体系）10*Buffer---5μldNTP---1μlMgCl2---3μlPrimerF---2μlPrimerR---2μlDNA---2μlTaq酶---1μlH2O---34μl反应程序预变性94C3min循环延伸72C5min。注：每组实验阴性对照用无菌生理盐水代替模板58C45s72C45s94C45s30循环（三）结果判读（四）PCR的常见问题及处理措施常见问题污染：表现为阴性对照同样出现目的条带或阴性对照出现‘S’形曲线。污染的来源：来自其他测试样品的DNA来自试验材料如重组克隆的DNA外源DNA污染来自同一靶序列前一次PCR的扩增产物。（三）PCR的常见问题及处理措施如何减少污染实验室分区酶法控制尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG)短于100bp的PCR产物不能用UNG完全消除污染。紫外线表面照射消除试剂、加样头中的DNA污染。对短PCR产物效果不好以预防污染为主良好的实验室操作三、荧光定量PCR（一）荧光PCR定量的概念以外参已知数量拷贝数的标准品为标准，通过扩增及对荧光值的监测，对PCR起始模板量的定量。（二）荧光定量PCR原理染料染色SYBR®GreenI溴乙锭(EthidiumBromide)探针标记TaqManTM分子信标(Molecularbeacons)TaqMan探针reverseprimerRQforwardprimer3'3'5'5'3'5'5'1.PolymerisationprobeQ3'3'5'5'3'5'5'2.StranddisplacementQ3'3'5'5'3'5'5'3.CleavageR3'5'5'3'5'5'4.PolymerisationcompletedQRR=ReporterQ=Quencher3'（三）定量PCR的数学原理PCR理论方程N=N0x(1+E)nN:扩增数量N0:起始模板数量E：扩增效率n:循环数指数期PCR定量方程才有效Log[DNA]循环数线性增长期Linear平台期Plateauy=x(1+e)n指数增长期GeometricPCR曲线线性图谱半对数图谱起点定量与终点定量起点定量终点定量“加进不同拷贝的膜板”半对数图谱线性图谱同一个样品重复96次起点定量的优势终点产物数量：误差太大拐点产物数量：重现性好起始DNA量，更具意义重现性好，误差小起点定量的关键：CT值CT值：荧光信号有统计学意义显著增长(穿过阈值线)时的循环次数CT值半对数图谱CT值线性图谱CT起始DNA浓度当循环次数n=CT值时：RT=RB+X0(1+E)CTRslg(RT-RB)=lgX0+CTlg(1+E)+lgRsCTlg(1+E)=-lgX0+lg(RT-RB)–lgRs)1log(log)log()1log(logXSBTXOTERRREXC即CT=-klgX0+b（线性方程）Rn=RB+X0(1+E)nRsCT值-X0作图CTX0CT=-klogX0+b四、PCR检测的临床应用（一）标本采集要求项目标本采集HBV无菌注射器抽取2毫升静脉血或其它体液注入无菌试管或抗凝管。HCVEB1.鼻咽拭子或体液标本。2.也可取抗凝血标本,但一般不推荐。CMV1.尿液：中段晨尿20ml于加盖试管。2.其他体液标本或咽拭子。3.也可取抗凝血标本,但一般不推荐。TB1.痰液：患者深部咳痰1～3ml于无菌加盖试管。2.其他组织标本：留于无菌试管。。3.也可取抗凝血标本,但需分离单个核细胞检测，阳性率才会高。（于发热时抽取）MP咽拭子项目标本采集所需容器CT男性：尿道分泌物：细小棉拭子伸入尿道约2～4厘米，旋转数圈取出分泌物（应略带粘膜）。前列腺液、精液。女性：阴道分泌物：用无菌生理盐水洗去宫颈外分泌物，再用无菌棉拭子插入宫颈内，停5秒后旋动棉拭子采取分泌物。尿道分泌物：同上一次性无菌带盖的试管。NGUUTPHPVHSV（二）结果分析、报告及解释1.定性PCR与定量PCR的比较2.定量PCR测定的临床意义3.定性PCR测定的临床意义4.定性和定量测定的结果报告及解释1.定性PCR与定量PCR的比较定性PCR定量PCR反应方式2步法3步法2步法3步法反应液成分dNTP，引物，模板，酶，Mg2+dNTP(dUTP替代dTTP)，引物，模板，酶，Mg2+,探针，UNG酶结果检测琼脂糖凝胶电泳实时荧光检测结果报告阴性或阳性定量数值琼脂糖凝胶电泳定量PCR扩增曲线图2.定量PCR的临床意义对致病微生物核酸含量进行定量检测弥补免疫检测的缺陷缩短诊断的窗口期（如HBV,HIV）对治疗过程进行药物疗效监测用于基因表达方面的研究某患者HBV-DNA的PCR结果动态图HBV-DNA0.02.04.06.08.010.01187320417530628740HBV-DNA日期HBV-DNA2004-6-39.3E+72004-12-72.0E+62005-4-191.8E+32005-7-250.0E+03、定性测定的临床应用诊断用于筛检耐药突变检测病毒基因型检测GGAGGGAGAAAA4.定性和定量测定的结果报告及解释（1）定性阴性阳性（2）定量(以我科参考值为例)HBV-DNA100IU/ml(不同项目数值不同)大于参考值，在检测范围之内，是多少报多少。大于107拷贝/ml，日常生活接触强传染性。小于105拷贝/ml，日常生活接触传染性较小但不管HBV-DNA的浓度为多少，哪怕是低于检测下限，也均会引起输血后的感染。（3）血浆HBV-DNA浓度与传染性强弱的问题谢谢