基因工程大题

2基因工程操作的基本步骤是什么？①施工材料的准备，即目的基因、载体、工具酶和受体细胞（宿主）的准备。用限制性内切酶分别将外源DNA和载体分子切开。（切）②目的基因与载体DNA的体外重组，形成重组DNA分子。（接）③把重组的DNA分子引入受体细胞，并建立起无性繁殖系。（转和扩④筛选出所需要的无性繁殖系，并保证外源基因在受体细胞中稳定遗传、正确表达。（检）3如何理解基因工程的两个特点？答：基因工程的两个基本特点是分子水平的操作和细胞水平的表达。分子水平的操作包括DNA分离、切割和连接（还有其他一些DNA的修饰等）。由于体外重组DNA的最终目的是要改变生物的遗传性，所以分子水平的操作和细胞水平的表达是基因工程的两个最基本的特点。4基因克隆是如何使含有单个基因的DNA片段得到纯化的？答：大分子质量的DNA会含有许多特殊限制性内切核酸酶的限制位点，因此用一种限制酶处理一完整染色体或整个基因组会产生许多不同的DNA片段，每一个片段带有基因组的一个不同的基因或一个不同的小片段。当全部片段与用同种限制酶处理过的载体分子混合时（如图所示），每个片段将插入一个不同的载体分子(如一个质粒)。同样地，当用这些质粒转化宿主细胞时，每个宿主细胞将只接收一个质粒DNA分子，而筛选出的含重组质粒的每个菌落实际上会含有某一特异的供体DNA片段的多个拷贝。一旦带有待研究的特定基因的克隆被确认了，此重组DNA分子可从宿主细胞中提取出来进行纯化。5比较遗传工程、基因工程和生物技术。答：遗传工程是遗传学和工程学相结合的一门技术科学。借用工程技术上的设计思想，在离体条件下，对生物细胞、细胞器、染色体或DNA分子进行按图施工的遗传操作，以求定向地改造生物的遗传性。遗传工程的概念有广义和狭义之分。狭义的遗传工程就是指基因工程。基因工程（geneengineering）又称基因操作（genemanipulation）、重组DNA（recombinantDNA）。基因工程是以分子遗传学理论为基础，以分子生物学和微生物学的现代方法手段，将不同来源的基因(DNA分子)，按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性，获得新品种，生产新产品，或是研究基因的结构和功能。生物技术又称生物工艺学，生物工程学。是根据生物学、化学和工程学的原理进行工业规模的经营和开发微生物、动植物细胞及其亚细胞组分，进而利用生物体所具有的功能元件(如基因、蛋白质)等来提供商品或社会服务的一门综合性科学技术。它包括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程等。6说明SangerDNA测序法的原理。答：SangerDNA测序法建立在两个基本原理之上：①核酸是依赖于模板在聚合酶的作用下由5’端向3’端聚合；②可延伸的引物必须能提供游离的3’羟基末端，双脱氧核苷酸由于缺少游离的3’羟基末端，因此会终止聚合反应的进行。如果分别用四种双脱氧核苷酸终止反应，则会获得四组长度不同的DNA片段。通过比较所有DNA片段的长度可以得知核苷酸的序列。11当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时，若要进行双酶切，应采取什么措施?为什么?答：注意星号活性；先低盐，后高盐；先低温酶，后高温酶；并且可以直接在换酶前将第一种酶失活，再加第二种酶，否则，易产生星号活性，或使用通用缓冲液。12．何谓限制性物理图谱？答：限制性物理图谱即限制性内切核酸酶作图(restrictionmapping)。简单地说就是DNA分子中限制性内切核酸酶切割位点的定位，即DNA分子中各种不同限制性内切核酸酶的酶切位点的线性排列图。标明限制酶在DNA分子上的限制性位点的数目、限制性片段大小及其线性排列的顺序。13什么是细菌的限制—修饰系统(RestrictionModificationSystem，R-Msystem)?答：细菌中有作用于同一DNA的两种酶，即分解DNA的限制酶和改变DNA碱基结构使其免遭限制酶分解的修饰酶。而且，这两种酶作用于同一DNA的相同部位，把这两种酶所组成的系统称为限制与修饰系统。14细菌的限制—修饰系统有什么意义?答：不同种的细菌或不同的细菌菌株具有不同的限制酶和修饰酶组成的限制与修饰系统。修饰的本质是通过甲基化酶将DNA中某些碱基进行甲基化修饰，由于宿主自身DNA上的这些位点进行了修饰，限制酶就不能进行切割。而外来的DNA在相应的碱基上没有被甲基化，宿主的限制酶通过对该位点的识别来分辨敌我，并将入侵的外来DNA分子降解掉。所以DNA限制作用和修饰作用为细胞提供了保护。15说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。答：基本原则：属名+种名+株名十序号。①首字母：取属名的第一个字母，且斜体大写。第二个字母：取种名的第一个字母，斜体小写。第三个字母：取种名的第二个字母，斜体小写。第四个字母：若有株名，株名则作为第四个字母，用正体。②顺序号：若在同一菌株中分离了几种限制酶，则按先后顺序冠以I、II、III等，用正体。③所有的限制酶，前面还应带有系统的名称,如限制性核酸内切酶R.HindIII。修饰酶则在前面加上甲基转移酶M，如甲基转移酶M.HindIII。在上下文已清楚只涉及限制酶的地方，R可被省去。16何谓限制性内切核酸酶的切割频率?答：切割频率是指限制性内切核酸酶在某DNA分子中预测的切点数。由于DNA是由四种类型的单核苷酸组成，假定DNA的碱基组成是均一的，而限制性内切核酸酶的识别位点是随机分布的，那么对于任何一种限制酶的切割频率，理论上应为1／4n，n表示该限制酶识别的碱基数。如识别4个碱基的限制酶，其切割频率应为每256个碱基有一个识别序列和切点（1／44=1／256），识别5个碱基的限制性内切核酸酶，其切割频率应为每1024个碱基有一个识别序列和切点，余类推。18双酶消化法（doubledigest）绘制限制性内切核酸酶酶谱的原理是什么?答：双酶消化法是绘制DNA中两个或两个以上限制性内切核酸酶图谱所采用的方法。做法是在两个限制性内切核酸酶分别单独消化DNA分子的基础上，再用这两个酶同时或先后消化DNA，根据它们的结果构建物理图谱。17什么是限制性内切核酸酶的星号活性？受哪些因素的影响?答：II类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定环境条件下表现出来的特异性。条件发生改变，限制酶的特异性就会松动，识别的序列和切割都有一些改变。改变后的活性通常称第二活性，而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示，因此第二活性又称为星号活性。诱发星号活性的因素有如下几种：①高甘油含量(＞5％，v／v)；②限制性内切核酸酶用量过高(＞100U／gDNA)；③低离子强度(＜25mmol／L)；④高pH(8．0以上)；⑤含有有机溶剂，如DMSO、乙醇等；⑥有非Mg2+的二价阳离子存在（如Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等）。19什么是DNA多态性(DNApolymorphism)?答：在正常人群中，各个体DNA分子的某些位点可以发生中性改变，这些改变虽然会使DNA一级结构产生一定变化，但不影响基因的表达，如果这种中性突变在人群中的频率不低于1％，这一现象被称为多态性。DNA多态性本质上是染色体DNA中核苷酸数目或排列顺序的个体差异，这些差异多数为中性突变，不引起表型改变。20什么是限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)？答：当DNA序列的差异发生在限制性内切核酸酶的识别位点时，或当DNA片段的插入、缺失或重复导致基因组DNA经限制性内切核酸酶酶解后，其片段长度的改变可以经凝胶电泳区分时，DNA多态性就可应用限制性内切核酸酶进行分析，这种多态性称为限制性片段长度多态性(RFLP)。22何为回文序列？答：回文序列（palindromicsequence）是一段自我互补的序列，即同其互补链一样的序列（两者的阅读方向都是从5’→3，)。根据回文序列的结构可分为：完全的回文序列、不完全的回文序列和间断的回文序列。完全回文序列（如GAATTC），通常是限制性内切核酸酶的识别序列；不完全的回文序（TACCTCCAT,CGTGATA），常是其他蛋白质的结合位点(如阻抑蛋白)，在基因表达调控中有重要作用；间断的回文序列（如GGTTXXXAACC，有一段是颠倒的重复），它可使单链的核苷酸有可能在tRNA中所见到的一样，形成发夹环的结构。23DNA连接酶的连接机理是什么？答：DNA连接酶是利用ATP或NAD+[烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化型)]提供的能量催化DNA双链间的缺口形成磷酸二酯键。在连接反应中，首先ATP(NAD+)与DNA连接酶反应，同连接酶生成一种共价结合的酶-AMP复合物。其中AMP(腺苷一磷酸)通过一种磷酸酰胺键同DNA连接酶的赖氨酸残基的ε-氨基相连。同时释放出焦磷酸或烟酰胺单核苷酸（NMN）。AMP激活DNA一条链的5’-末端磷酸基团,并转移到磷酸基团上，形成DNA-腺苷一磷酸复合物。最后，3’-OH对激活的磷原子作亲核攻击，形成磷酸二酯键，同时释放出AMP。连接反应是由在形成酶-腺苷酸复合体时，焦磷酸水解和释放提供的能量驱动下进行的。在以ATP作为能源的连接酶中，一个磷酸二酯键的形成消耗掉两个高能磷酸键。29列举质粒载体必须具有的基本条件。答：(1)能独立复制；(2)具有选择标记；(3)有独特的酶切位点；(4)能转化但不扩散。24DNA连接酶的作用特点有哪些？①连接反应需要在一条DNA链的3’末端具有一个游离的-OH,而另一条DNA链的5’末端具有一个磷酸基团(-P)的情况下，才能发挥其连接DNA分子的功能作用，而在末端带有5’-羟基和3’-羟基；5’-磷酸和3’-二脱氧核苷基团的两个DNA片段之间不起连接作用。②连接反应中需要ATP或NAD+和Mg2+为辅助因子和激活因子；③DNA连接酶不能够连接两条单链的DNA分子，被连接的DNA链必须是双螺旋的一部分。④DNA连接酶只封闭双螺旋DNA骨架上的缺口(Nick)，即在双链DNA的某一条链上两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂，而不能封闭双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的裂口25影响DNA连接酶连接反应的因素主要有哪些？答：1)反应温度：最佳反应温度37℃，但黏性末端之间退火形成的氢键结合不稳定，连接黏性末端的最佳温度，一般认为4～20℃比较合适。2)DNA片段末端：不仅要考虑反应体系中DNA末端的总浓度，还要考虑载体与插入片段的末端浓度的比例。原则上应保证一个DNA分子的末端有较高的几率与另一DNA分子连接，减少同一个分子两个末端之间的自身连接。载体与插入片段3：1~1：3。3)连接酶浓度：平末端DNA分子的连接反应，最适酶量大约是1～2单位；而黏末端DNA片段间的连接，在同样的条件下，仅为0.1单位时，便能得到最佳连接效率。28切口平移法制备DNA探针的原理是什么？答：在Mg离子存在时，用低浓度的DNA酶I（DNaseI）处理双链DNA，使之随机产生单链断裂。然后用DNA聚合酶I的5'→3'外切酶活性可以从断裂处的5'端除去一个核苷酸，而其聚合酶活性则将一个单核苷酸添加到断裂处的3'端。随着反应的进行，即5'端核苷酸不断去除，而3'端核苷酸同时掺入，导致断裂形成的切口沿着DNA链按合成的方向移动，这种现象称为切口平移。如果在反应体系中加入放射性同位素标记的核苷酸，则这些标记的核苷酸将取代原来的核苷酸残基，产生带标记的DNA分子，用作DNA分子杂交探针。27碱性磷酸酯酶主要有两种，细菌碱性磷酸酯酶（BIP）和小牛肠碱性磷酸酯酶（CIP），二者有什么不同？在基因工程中有什么用途？答：主要差别是CIP在68℃时失活，而BAP在68℃稳定，且耐酚抽提。应用：①dsDNA的5’端脱磷酸，防止DNA的自身连接。但是用CIP处理后，最好将CIP除去，再进行连接反应。②DNA和RNA脱磷酸，然后用于多核苷酸激酶进行末端标记。30举例说明什么是穿梭载体？答：穿梭载体是含有细菌质粒和克隆的真核生物DNA片段的杂种质粒