基因工程实验设计

基因工程实验设计DNA重组分子的构建及筛选检测实验原理：Bt蛋白中的Bt是苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensis的缩写。毒蛋白是其产生的一种伴胞晶体，有时也称为delta-endotoxin，即学术刊物中中文所对应“delta内毒素”。“毒”是指其对特定的物种有毒性，并非对所有的生物体都有毒性。而且不同的Bt菌系产生的毒蛋白的特异性也不同。Cry14-4是从苏云金芽孢杆菌中获得的一中新的杀虫晶体蛋白样基因，对棉铃幼虫有较强的杀虫活性。实验步骤一．目的基因的获得1.在NCBI网站上查找目的基因的核心序列1atgtatatggctgaaattaaacgtttagattattatttaggtgccttgccttttggtaat61ttttatgtagatgattgtgatactttaaaaaattttatagatagccttttagatggtaaa121ccttctacaatgaataatactcctctaacaggtaatgtaaatgttacaaatcaaagtgtt181actatcttagatgatttagattccatagcaaccctaaccccagaatatgtatatgataat241tatttttctaatgatacaagtactgaaaaaacttatcaaaccttatcttttgagaaagat301gtacaaacaacagttagtacaactgttacccatggattccaaattggagggaaacttgga361gctgaagtaaaaggaagtgtaagtattcctttcgttgcagatggtggggttactgtaagt421gcagaaatttctggacaatataatttttcttcagcagatacagaaacaacaacaacttct481caaaaattaattattccttctcagtccggtaacattcgacctggttatacaacaagggtt541caaattatgttagcaaaaattaatattccacaaacagcagttcatttttctggttctatg601tcaggaacagtacatcgggatccaatccctagtagtgtaataggtttggtagactacgat661ttatatgatgaagtaaggtctctagaaaataattgttcaaattcaacagtaggtagagat721acaggtttagtattaaataacgctaatcaaagtgtagatttttcaggaagtggatttttt781actggttcaattactgcatttaatttttatgtaaaaattactgaatatccaattaataat841tcttcccaagaaaatataagatggtactcaatagaaccaaaagtattaaatcaatcaatt901atacgacatcgttttccttcaaattcttctgtgaatacttgtaattgctaa2.根据所查序列运用primer5.0进行引物设计3.确定适合引物的序列及位置,设计酶切位点及加保护碱基上游引物：5’CCCCGGGATGTATATGGCTGAAA3’Sma1下游引物：5’CGAGCTCTTAGCAATTACAAGTACC3’Sac1所选限制性内切酶酶切序列及酶切点:Sma1:CCC↓GGGSac1:GAGCT↓C4.菌体培养：将获得的苏云金芽孢杆菌于YT液体培养基，于30℃振荡培养过夜，获得足够的菌体。收集菌体(注意吸干多余的水分)。辅助裂解：如果是G+菌，应先加溶菌酶100μg/mL50μL。37℃处理1h。运用CTAB法提取DNA。将提取的DNA用PCR扩增获得目的片段。二．构建克隆载体质粒（pEASY-T1质粒）1.连接T载体，转化大肠杆菌，涂平板（LB固体培养基加Kan和Amp），37℃培养12-16小时后，菌检（M13引物）。附图：质粒pEASY-T1图谱原理：很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的碱基A。pEASY-T1载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的T。这样，pEASY-T1载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到pEASY-T1载体中，形成含有目的片断的重组载体。反应体系：T载体，T4DNA连接酶，连接酶缓冲液10xbuffer，无菌ddWater2.从菌检正确的菌落上挑菌摇菌（LB液体培养基加Kan和Amp）12-16h后，提取质粒，送去检测。三．表达载体的构建（pBI121质粒）附图：pBI121质粒图谱酶切体系：30°CTangoTMbuffer1XSma1Sac11.将目的片段确定正确的T质粒酶切，跑胶，切胶回收，获得带酶切位点的的目的片段，目的载体PBI121也进行酶切，跑胶，切胶回收。2.将酶切片段和酶切后的载体连接。四．目的基因的检测与筛选1.将表达载体运用CaCl2法转化大肠杆菌，涂平板（LB固体培养基加Kan），12-16h后，菌落PCR（所设计的引物）。2.从菌检正确的菌落上挑菌摇菌（LB液体培养基加Kan和Amp）12-16h后，提取质粒。进行酶切验证。将酶切验证结果正确的菌落的质粒转化农杆菌，涂平板（YEB固体培养基+Kan+Rif），长出菌落后，菌检（所设计的引物），将菌检正确的菌落挑菌，摇菌，提取质粒，进行酶切验证，将酶切验证正确的菌落，保存菌液。3.从检测正确的菌斑上挑菌，摇菌（YEB液体培养基+Kan+Rif），转化拟南芥，筛选转基因植物。4.对筛选出来的纯合子，稳定遗传的转基因植株检测其抗虫性，确定该基因的抗虫功能（农杆菌侵染转化法）。