第九章吸光光度法分析

第九章吸光光度法Spectrophotometry9-1吸光光度法基本原理9-2光度计及其基本部件9-3显色反应及显色条件的选择9-4吸光度测量条件的选择9-5吸光光度法的应用9-6紫外吸收光普法简介11:16:33概述吸光光度法是基于被测物质的分子对光具有选择吸收的特性而建立的分析方法。1.比色法2.可见分光光度法3.紫外分光光度法11:16:33目视比色法标准系列未知样品特点利用自然光比较吸收光的互补色光准确度低（半定量）不可分辨多组分方法简便，灵敏度高11:16:33分光光度法（紫外-可见分光光度法）UV-VIS0.575光源单色器吸收池检测器显示I0It参比样品bCTIIAtlglg0未考虑吸收池和溶剂对光子的作用入射光I0透射光It入射光I0透射光It注意比较11:16:33吸光光度法特点：1）检出限低10-5-10-6mol/L2）灵敏度高，适于测定微量组分3）误差2-5%4）测定迅速、操作简单、价格便宜，应用广泛11:16:339-1吸光光度法基本原理射线x射线紫外光红外光微波无线电波10-2nm10nm102nm104nm0.1cm10cm103cm105cm可见光一、物质对光的选择性吸收11:16:33单色光、复合光、光的互补单色光复合光光的互补单一波长的光由不同波长的光组合而成的光若两种不同颜色的单色光按一定的强度比例混合得到白光，那么就称这两种单色光为互补色光，这种现象称为光的互补。蓝黄紫红绿紫黄绿绿蓝橙红蓝绿11:16:33完全吸收完全透过吸收黄色光光谱示意表观现象示意复合光11:16:33光吸收原理物质的电子结构不同，所能吸收光的波长也不同，这就构成了物质对光的选择吸收基础。分子的紫外-可见吸收光谱是由电子跃迁引起的，故又称电子光谱.纯电子能态间跃迁S2S1S0S3hE2E0E1E3Ah分子内电子跃迁带状光谱A锐线光谱S2S1S011:16:33吸收光谱（吸收曲线）测量某物质对不同波长单色光的吸收程度，以波长（）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制吸光度随波长的变化可得一曲线，此曲线即为吸收光谱。用来描述物质对不同波长光的吸收能力。11:16:33吸收曲线的讨论：①同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长λmax②不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似λmax不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和λmax则不同。③吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据之一。11:16:33讨论：④不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度A有差异，在λmax处吸光度A的差异最大。此特性可作作为物质定量分析的依据。⑤在λmax处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定最灵敏。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。11:16:33定性分析与定量分析的基础定性分析基础定量分析基础物质对光的选择吸收ABA)(maxA)(maxB在一定的实验条件下，物质对光的吸收与物质的浓度成正比。AC增大11:16:33二、光吸收的基本定律-朗伯-比尔定律透光率（透射比）Transmittance透光率定义：0IITtT取值为0.0%~100.0%全部吸收T=0.0%全部透射T=100.0%入射光I0透射光It入射光I0透射光It11:16:33吸光度与透光率AbsorbanceandtransmittanceAKcbTlgT：透光率A：吸光度1.00.50ACA100500T%TKbcAT1010T=0.0%A=∞T=100.0%A=0.0A=0.434T=36.8%11:16:33吸光系数AbsorptivityKcbAb吸光液层的厚度，光程，cmc吸光物质的浓度：g/L,mol/LK比例常数入射光波长物质的性质温度取值与浓度的单位相关c：mol/LK（或k）摩尔吸光系数，L·mol–1·cm-1c：g/LKa吸光系数，L·g–1·cm-1cbAacbAc：g/100mLK比吸光系数%11cmEcbEAcm%11MaEcm1010%11相互关系100mL·g–1·cm-111:16:34吸光的加合性多组分体系中，如果各组分之间无相互作用，其吸光度具有加合性，即iiiiiiiicbbcAA对吸收定律偏离AC主要原因非单色光吸光质点的相互作用11:16:34非单色光引起的对吸光定律的偏离设入射光由1和2两种波长组成，溶液的吸光质点对两种波长的光的吸收均遵从吸收定律1bcIIA11011lgbcλII1100112bcIIAλ22022lgbcλII2100221+2210201lgIIIIAbcbcIIII2λ1λ1010lg0201020121λλbcA1或bcA221λλbcA1或bcA211:16:34非单色光引起的对吸光定律的偏离对吸收光谱而言，b和c固定，iKA反映了随波长变化的情况，单一波长，固定；不同波长，不同。因此，非单色光将导致对吸光定律的偏离。A或12在实际工作中，入射光通常具有一定的带通。为了避免非单色光带来的影响，一般选用峰值波长进行测定。1对应的1较小2对应的2较大选用峰值波长，也可以得到较高的灵敏度。11:16:34吸光质点间相互作用引起的对吸光定律的偏离质点间的静电作用质点间的缔合作用质点间的化学反应11:16:340.575光源单色器吸收池检测器显示I0It参比样品bcTIIAtlglg0未考虑吸收池和溶剂对光子的作用入射光I0透射光It入射光I0透射光It注意比较9-2光度计及其基本部件11:16:34单波长单光束分光光度计0.575光源单色器吸收池检测器显示11:16:34比值光源单色器吸收池检测器显示光束分裂器单波长双光束分光光度计11:16:34双波长将不同波长的两束单色光(λ1、λ2)快速交替通过同一吸收池而后到达检测器。产生交流信号。无需参比池。△=1～2nm。ΔA=Aλ2-Aλ1=(ελ2-ελ1)bc=Kc11:16:34一、基本组成generalprocess光源单色器样品室检测器显示1.光源在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。分光光度计中常用的光源有热辐射光源和气体放电光源两类可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在320～2500nm。紫外区：氢、氘灯。发射185～400nm的连续光谱。11:16:342.单色器将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长单色光的光学系统。①入射狭缝：光源的光由此进入单色器；②准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束；③色散元件：将复合光分解成单色光；使不同波长的辐射以不同的角度进行传播；棱镜或光栅；④聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；⑤出射狭缝。11:16:34棱镜—根据光的折射现象进行分光棱镜对不同波长的光具有不同的折射率，波长长的光，折射率小；波长短的光，折射率大。平行光经过棱镜后按波长顺序排列成为单色光；经聚焦后在焦面上的不同位置上成像，获得按波长展开的光谱；棱镜的光学特性可用色散率和分辨率来表征；11:16:34光栅通过在平板玻璃或金属板上刻划出一道道等宽、等间距的刻痕制成。常用的光栅刻痕密度每毫米为1200条、1800条或2400条；根据工作方式不同分为：透射光栅，反射光栅；光栅光谱的产生是多狭缝干涉与单狭缝衍射共同作用的结果，前者决定光谱出现的位置，后者决定谱线强度分布；11:16:34光栅的色散原理11:16:34狭缝单色器的进口狭缝起着单色器光学系统虚光源的作用。复合光经色散元件分开后，在出口曲面上形成相当于每条光谱线的像，即光谱。转动色散元件可使不同波长的光谱线依次通过。11:16:343.样品室样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。4.检测器利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管。5.结果显示记录系统检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理11:16:34紫外-可见分光光度计组件光源单色器样品池检测器信号输出氢灯，氘灯，180~375nm；卤钨灯，250~2000nm.基本要求：光源强，能量分布均匀，稳定作用：将复合光色散成单色光棱镜光栅玻璃，350~2500nm,石英，185~4500nm平面透射光栅，反射光栅玻璃，光学玻璃，石英作用：将光信号转换为电信号，并放大光电管，光电倍增管，光电二极管，光导摄像管（多道分析器）表头、记录仪、屏幕、数字显示基本组成总结11:16:349-3显色反应及显色条件的选择显色反应显色反应：将待测组分转变成有颜色化合物的反应在吸光光度分析中所用到的显色反应主要有配位反应、氧化还原反应等。用于吸光光度分析的显色反应应满足下列要求：⑴选择性好，干扰少；⑵灵敏度高；εmax=104-105→灵敏度高εmax103→灵敏度低⑶有色化合物的组成恒定；⑷有色化合物的性质稳定⑸色差大Δλ〉60nmMRMR（待测组分）（显色剂）（有色化合物）11:16:34显色条件的选择吸光光度法是测定显色反应达到平衡后溶液的吸光度，为了得到准确的结果，必须从研究平衡着手了解影响显色反应的因素，控制适当的条件，使反应完全和稳定。11:16:34显色反应的主要条件显色的主要条件有以下几点：（1）显色剂用量显色反应一般可以用下式表示：M+R＝MR为了减少反应的可逆性，根据同离子效应，加入过量的显色剂是必要的，但过量太多，有时会有副反应产生，反而不利。11:16:34吸光度与显色剂用量关系图是吸光度与显色剂用量关系的几种情况。图2－11吸光度与显色剂用量的关系从三个图中可以得到：1)可以选用的用量较宽2)可以选用的用量较窄3)表明随着显色剂用量的增加，吸光度也不断增大。11:16:34（2）溶液的酸度溶液的酸度对显色反应的影响是多方面的:例如由于显色剂大多是有机弱酸，酸度影响显色剂的离解，因而影响显色剂反应的完全程度。又如许多显色剂本身就是酸碱指示剂，配位反应后的颜色必须与显色剂本身的颜色有显著的不同。二甲酚橙pH6.3呈红紫色，pH6.3呈黄色，与金属配合物则呈红色，故只适合于pH6.3的条件。11:16:34（2）溶液的酸度酸度还影响配合物的组成，Fe3+与磺基水杨酸(Sal2-)的反应就是一个典型的例子。pH=1.8～2.5Fe3＋＋Sal2－＝Fe（Sal）＋紫红色pH=4～8Fe3＋＋2Sal2－＝Fe（Sal）2－紫褐色pH=8～11.5Fe3＋＋3Sal2－＝Fe（Sal）33＋黄色pH12配合物被破坏，生成Fe（OH）3沉淀11:16:34（3）显色时间的影响由于反应速率不同，完成反应所需的时间常有很大差别同时，有色化合物在放置过程中也会发生变化。有的迅速反应且能稳定较长时间（如Fe3+与磺基水杨酸反应）。有的放置一段时间反应才达平衡，溶液颜色才达稳定程度（如硅钼蓝的生成）。有的放置一段时间后由于各种原因，如空气氧化、试剂分解或挥发、光照射等而褪色（如硅钼蓝只稳定0.5～1h）。11:16:34（4）温度对显色反应也有影响如Fe3＋与磺基水杨酸反应室温就能进行，硅钼蓝的生成如果在沸水中则只需30s。11:16:34（5）干扰离子的影响及其消除有的干扰离子本身有颜色，如Cu2＋（蓝）、Co2＋（红）、Cr3（绿）、Fe3＋（黄）；有的与试剂生成有色配合物，如硅钼蓝法测Si时，P、As也与钼酸铵生成杂多酸且同时被还原成钼蓝干扰测定；有的与试剂或被测离子生成更稳定化合物，使被测离子配位不完全等。因此，对与一个新的比色方法的提出，往往必须做干扰离子试验。11:16:34干扰离子的消除对于干扰离子的消除通常采用下述方法。（1）加入配位剂掩蔽干扰离子如测Ti