安捷伦液相色谱飞行时间质谱(LCMSDTOF)对人尿中

作者BernhardWüstAgilentTechnologiesGmbH,Hewlett-Packardstr.8,76337Waldbronn,GermanyMarioThevisGermanSportUniversity,InstituteofBiochemistry,Carl-DiemWeg6,50933Cologne,Germany摘要采用垂直电喷雾飞行时间质谱(oa-ESI-TOF)建立对克伦特罗，马布特罗，班布特罗，拉克多巴胺等兴奋剂高灵敏定性定量的LC/MS分析方法。该方法在人尿中的最小检测限为2ng/mL，远低于控制水平。同时考察了分析精度，不同浓度的标准溶液和样品基质的检测中测量误差均小于3ppm。安捷伦液相色谱/飞行时间质谱(LC/MSDTOF)对人尿中ß2激动剂高分辨LC/MS定量分析应用前言ß2激动剂如克伦特罗，马布特罗，班布特罗和其他拟交感神经药物常用于肺部疾病如支气管哮喘等的治疗，1992年，拟交感神经类药物被国际奥委会反兴奋剂机构(IOC)列入禁用药物名单。该类被用作刺激剂和蛋白同化制剂的药物在比赛和赛外检测中受到特别限制。本文采用垂直电喷雾飞行时间质谱(oa-ESI-TOF)建立了对克伦特罗，马布特罗，班布特罗，拉克多巴胺等兴奋剂的高灵敏定性定量LC/MS分析方法。实验部分所有LC/MS实验均在Agilent1100液相色谱联用Agilent飞行时间质谱(TOF)LC/MSD分析系统上完成。TOF采用垂直电喷雾的正离子模式。液相色谱采用梯度洗脱模式。Clenpenterol作为所有分析物的内标(ISTD)。分析条件见表1。法庭科学2试剂HCl32%(例如，Merck公司，100319)叔丁醇KOH,85%碳酸钾无水碳酸氢钠氯化钠(Merck)叔丁基甲基醚，使用前蒸馏，(KMF,St.Augustin,Germany)无水醋酸钠，(Sigma)结果与讨论竞技体育兴奋剂控制需要对尿样中部分ß2激动剂进行检测。本方法检测的化合物结构见图1。从尿样中液液萃取提取出ß2激动剂。采用飞行时间质谱(TOF)确定精确质量并定量分析控制样品。质谱质量扫描采取全扫描模式，可监测整个质量范围内所有可离子化的化合物。质谱参数不需要特殊设定。因此当需要增加新的分析物时，无需改变现有分析方法。HNH2NClClOHH3CCH3CH3HNOHOONNOOH3CH3CCH3CH3CH3CH3CH3HNH2NOHH3CCH3CH3FFFClOHOHCH3NHHOHNH2NOHH3CCH3CH3ClClClenpenterol(ISTD)图1.本方法研究的ß2激动剂的化学结构式HPLCAgilent1100色谱柱ZORBAXXDB-C18,50mmx2.1mmx3.5µm洗脱溶剂A:水+5mM的NH4Ac+0.1%乙酸B:乙腈+0.1%-乙酸淋洗梯度5%A,0-7min;80%A,7-9min流速0.3mL/min进样:20µL(从1000µL样品溶液中取出)AgilentLC/MSDTOF系统离子源模式:正ESI模式喷雾器压力:45psi干燥气流速:11L/min干燥气温度:350°C全扫描模式100amu-1000amu自动参比离子Ion122andIon922定量BambuterolEICof368.20750-368.22959,班布特罗保留时间:6.3minClenbuterolEICof277.07858-277.09520,克伦特罗保留时间:5.8minMabuterolEICof311.10392-311.12258,马布特罗保留时间:6.45minRactopamineEICof302.16600-302.18413,拉克多巴胺保留时间:5.35minClenpenterol(ISTD)EICof291.09381-291.11128+EICof293.09080-293.10839,保留时间:6.4min校正曲线:数据权重为1/x表1.实验条件样品处理样品按照德国体育大学生物化学学院建立的协议进行前处理。根据协议，在5mL的尿样中，加入300µL浓度为10M的盐酸和250ng的clenpenterol。在80˚C恒温45min。冷却至室温后，加入5mL叔丁基甲基醚，混合物振摇15min。以转速为620g离心5min，弃去有机相。在保留的水相中，依次加入0.65mLof5MKOH溶液，1mL叔丁醇，500mgK2CO3和NaHCO3的混合物(2:1,w/w)，2gNaCl，以及5mL的叔丁基甲基醚。该混合物振摇15min，然后以转速为620g离心10min。有机相转入干净试管，50˚C真空干燥。干燥后的残渣用1mL的0.06MHCl溶解，转入HPLC样品瓶中，取20µL进样至LC/MS系统中。克伦特罗班布特罗马布特罗拉克多巴胺3定性通过运用自动化的经验公式进行常规检索。运行时间工作表允许自动化的经验公式计算，后台采集，以超文本链接方式报告以及逗点分割数据的电子表格形式以便进一步进行数据处理。图4为添加标准样品的尿样的计算所得的质量精度曲线。它表明，对于标准样品和实际样品，该系统常规分析的质量精度分析误差小于3ppm。选择准分子离子峰进行质谱监测，形成分析物和内标的提取离子色谱图(EICs)，从而实现定量分析。图2为尿样基质中样品含量为2ng/mL的提取离子色谱图。图3是以尿样为基质的标准工作曲线。表2为工作曲线的数据统计。国际奥委会列出了被禁用的部分ß2激动剂的控制限。作为蛋白同化剂的克伦特罗和沙丁胺醇类，其控制检出限为1µg/mL，如图所示本方法的检出能力远优于控制限。3.0e42.0e41.0e40.01.2e48000.04000.00.01.2e48000.04000.00.090006000300004.04.05.05.06.06.07.07.08.04.05.06.07.08.04.05.06.07.03.08.06.346.504.495.405.936.185.84图2.添加2ng/mL标样的尿样的标准提取离子色谱图4.02.00.00501001502002504.02.00.01.60.80.00501001502002500.800.400.0050100150200050100150200图3.添加尿样的校正曲线(2ng/mL-250ng/mL)化合物提取浓度样品瓶低值高值平均标准偏差%CV%精确度ng/mLng/mLng/mLng/mL班布特罗251.591.671.650.0352.10482.4050558.1158.5658.360.1850.318116.721005110.50111.93111.270.6400.575111.272505211.46247.25232.4017.9347.71792.96马布特罗252.022.092.060.0261.243102.9050548.7249.1148.920.1880.38597.85100595.62108.1798.394.8074.88698.392505250.48256.32253.692.6741.054101.47克伦特罗252.052.172.090.0512.455104.5050547.6548.7748.240.4220.87696.49100596.2798.0597.250.7150.73697.252505226.79263.17254.4115.5456.110101.77拉克多巴胺252.142.242.210.0401.832110.5150544.2745.7845.090.7051.56390.18100595.1396.5995.710.6320.66195.712505232.60267.43258.9914.8255.724103.60表2.标准工作曲线数据统计尿样2ng/mL-班布特罗(标准物)368.2-368.2amu尿样2ng/mL-克伦特罗(标准物)277.1-277.1amu班布特罗克伦特罗响应值,cps响应值,cps响应值,cps响应值,cps时间,min时间,min时间,min时间,min尿样2ng/mL-马布特罗(标准物)311.1-311.1amu尿样2ng/mL-拉克多巴胺(标准物)302.2-302.2amu马布特罗拉克多巴胺分析物面积/内标面积分析物面积/内标面积分析物面积/内标面积分析物面积/内标面积分析物浓度/内标浓度分析物浓度/内标浓度分析物浓度/内标浓度分析物浓度/内标浓度班布特罗克伦特罗马布特罗拉克多巴胺安捷伦科技公司对本材料中可能有的错误或与装置、性能及材料使用有关内容而带来的意外伤害和问题不负任何责任。本材料内容如有改变，恕不另行通知。©安捷伦科技有限公司，2004中国印刷2004年12月14日5989-1946CHCN结论用AgilentLC/MSDTOF系统，建立了对人尿中ß2激动剂LC/MS定性及定量的分析方法。在人尿中的最小检测限为2ng/mL，远低于控制水平。并且质量分析精度的误差在标准样品和实际样品的各个浓度水平均低于3ppm。参考文献1.MarioThevis,(2003)LiquidChromatogra-phy/ElectrosprayIonizationTandemMassSpectrometricScreeningandConfirmationMethodsforß2-AgonistsinHumanorEquineUrineJ.MassSpectrom.,38,1197–1206.更多信息如欲了解更多产品与服务信息，敬请浏览如想了解更详细的实验细节，请发送电子邮件至[e-mail]与BernhardWüst联系图4.被测ß2激动剂在一个18小时检测序列的质量精度变化曲线-3-2-1012351015202530354045ClenbuterolRactopamineBambuterolMabuterol质量误差(ppm)浓度为0.1-5ng/mL的标准样品添加的尿样，2ng/mL-250ng/mL