实时荧光定量PCR一般流程

1Date|ABCONFIDENTIALStepOne™andStepOnePlus™Real-TimePCRSystems©2006AppliedBiosystemsLUYangApplicationSpecialistGeneCompanyLtd实时荧光定量PCR一般流程2Date|ABCONFIDENTIALStepOne™andStepOnePlus™Real-TimePCRSystems©2006AppliedBiosystems内容●实验目的●实验方案●实验关键●实验试剂耗材3Date|ABCONFIDENTIALStepOne™andStepOnePlus™Real-TimePCRSystems©2006AppliedBiosystems●实验目的●实验方案●实验关键●实验试剂耗材4Date|ABCONFIDENTIALStepOne™andStepOnePlus™Real-TimePCRSystems©2006AppliedBiosystems●未知样品中目的基因绝对量：绝对定量●比较不同样品中目的基因相对表达量：相对定量●检测未知样品基因型：SNP分析●检测未知样品中某种成分的存在与否：存在/不存在分析●………………实验应用目的5Date|ABCONFIDENTIALStepOne™andStepOnePlus™Real-TimePCRSystems©2006AppliedBiosystems不同实验应用，实验准备不同●未知样品中目的基因绝对量标准品：已知确切浓度，分子结构和目的基因类似梯度稀释：至少5个浓度梯度，必须覆盖未知样本目的片段所有可能量的范围样品重复：每一个梯度最好3个重复，保证统计学意义标准曲线：斜率和标准差必须要符合数学意义6Date|ABCONFIDENTIALStepOne™andStepOnePlus™Real-TimePCRSystems©2006AppliedBiosystems不同实验应用，实验准备不同●比较不同样品中目的基因相对表达量内参基因：用于数据均一化扩增效率比较：比较内参基因和目的基因的扩增效率，以确定相对定量的不同定量模式△Slope0.1，使用相对标准曲线法△Slope0.1，可以使用比较CT值法7Date|ABCONFIDENTIALStepOne™andStepOnePlus™Real-TimePCRSystems©2006AppliedBiosystems不同实验应用，实验准备不同●比较不同样品中目的基因相对表达量△Slope0.1，使用相对标准曲线法标准品：内参基因和目的基因，不需知道样品确切浓度浓度梯度：至少5个浓度梯度，必须覆盖未知样本目的片段所有可能量的范围样品重复：每一个梯度最好3个重复，保证统计学意义标准曲线：斜率和标准差必须要符合数学意义8Date|ABCONFIDENTIALStepOne™andStepOnePlus™Real-TimePCRSystems©2006AppliedBiosystems不同实验应用，实验准备不同●比较不同样品中目的基因相对表达量△Slope0.1，使用比较CT值法内参基因：数据均一化数学公式：2－△△CT9Date|ABCONFIDENTIALStepOne™andStepOnePlus™Real-TimePCRSystems©2006AppliedBiosystems不同实验应用，实验准备不同●检测未知样品基因型荧光探针：两种不同标记，不用两种不同基因型检测不同荧光表明基因型的不同10Date|ABCONFIDENTIALStepOne™andStepOnePlus™Real-TimePCRSystems©2006AppliedBiosystems不同实验应用，实验准备不同●检测未知样品中某种成分的存在与否IPC：阳性对照，检验反应体系工作与否目的基因探针：荧光信号有无判断存在与否11Date|ABCONFIDENTIALStepOne™andStepOnePlus™Real-TimePCRSystems©2006AppliedBiosystems●实验目的●实验方案●实验关键●实验试剂耗材12Date|ABCONFIDENTIALStepOne™andStepOnePlus™Real-TimePCRSystems©2006AppliedBiosystems实验应用方案：基本流程13Date|ABCONFIDENTIALStepOne™andStepOnePlus™Real-TimePCRSystems©2006AppliedBiosystems目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对GeneBank或者文献查找实验应用方案14Date|ABCONFIDENTIALStepOne™andStepOnePlus™Real-TimePCRSystems©2006AppliedBiosystems引物和探针设计遵循引物设计的一般规则，特别是多重反应的应用根据自身情况确定荧光探针的种类遵循所选探针设计的一般规则BLAST比对确认引物特异性实验应用方案15Date|ABCONFIDENTIALStepOne™andStepOnePlus™Real-TimePCRSystems©2006AppliedBiosystems荧光报告基因的选择根据自身仪器的性能根据自身实验条件尽可能选择相对成熟的荧光报告基团：FAM，VIC等选择高品质引物探针合成商实验应用方案16Date|ABCONFIDENTIALStepOne™andStepOnePlus™Real-TimePCRSystems©2006AppliedBiosystems标准品制备（标准曲线法）新鲜标准品遵循所有标准品制备原则实验应用方案17Date|ABCONFIDENTIALStepOne™andStepOnePlus™Real-TimePCRSystems©2006AppliedBiosystems退火温度热启动引物浓度引物和探针的纯度镁离子浓度模板质量模板浓度UNG处理实验应用方案PCR反应体系优化18Date|ABCONFIDENTIALStepOne™andStepOnePlus™Real-TimePCRSystems©2006AppliedBiosystems通常以3－15循环的荧光值作为阈值，也可以以阴性对照荧光值的最高点作为基线具体实验可以调整实验应用方案基线和阈值调节19Date|ABCONFIDENTIALStepOne™andStepOnePlus™Real-TimePCRSystems©2006AppliedBiosystems软件给出标准曲线和未知样品中起始模板的量：绝对定量通过得到的CT，套用现成公式进行定量：相对定量根据软件荧光图谱，判断基因型或者存在/不存在实验应用方案数据分析20Date|ABCONFIDENTIALStepOne™andStepOnePlus™Real-TimePCRSystems©2006AppliedBiosystems退火温度热启动引物浓度引物和探针的纯度镁离子浓度模板质量模板浓度UNG处理实验应用方案PCR反应体系优化21Date|ABCONFIDENTIALStepOne™andStepOnePlus™Real-TimePCRSystems©2006AppliedBiosystems退火温度热启动引物浓度引物和探针的纯度镁离子浓度模板质量模板浓度UNG处理实验应用方案PCR反应体系优化22Date|ABCONFIDENTIALStepOne™andStepOnePlus™Real-TimePCRSystems©2006AppliedBiosystems●实验目的●实验方案●实验关键●实验试剂耗材23Date|ABCONFIDENTIALStepOne™andStepOnePlus™Real-TimePCRSystems©2006AppliedBiosystems实验应用关键标准品制备和标准曲线制作重复样品PCR反应体系的优化荧光基团的正确选择24Date|ABCONFIDENTIALStepOne™andStepOnePlus™Real-TimePCRSystems©2006AppliedBiosystems●实验目的●实验方案●实验关键●实验试剂耗材25Date|ABCONFIDENTIALStepOne™andStepOnePlus™Real-TimePCRSystems©2006AppliedBiosystems实验应用试剂耗材根据自己应用目的选择相应的试剂选择高质量的试剂耗材供应商使用配套的试剂盒使用正确的耗材和试剂：StepOne为0.1ml光学反应管26Date|ABCONFIDENTIALStepOne™andStepOnePlus™Real-TimePCRSystems©2006AppliedBiosystemsThankyou!