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实验9植物原生质体的分离与纯化实验目的:2了解原生质体在植物体细胞遗传学上的意义。1学习植物原生质体的分离和纯化技术;实验原理:植物原生质体即为去除了细胞壁的植物细胞。分离原生质体的基本要求是获得大量的有活力的原生质体。去除细胞壁有两种方法,机械法和酶法。其中酶法是一种温和、有效的方法,但是仅局限于具有初生细胞壁的组织。植物的细胞壁由纤维素、半纤维素、果胶质和少量的蛋白质和脂类组成的,通常使用纤维素酶和果胶酶的混合酶液来分离原生质体。实验用品:用具:尼龙过滤网(400目)、双层漏斗、吸管、离心管、显微镜、剪刀、镊子、载玻片、盖玻片等。药品:纤维素酶、果胶酶、8%甘露醇盐溶液、20%蔗糖盐溶液等。实验材料:菠菜、油菜等。实验步骤:1取材:选取充分伸展开的幼嫩叶片,冲洗干净。3酶解:去除下表皮的叶片剪成小块,铺于酶液中,充分接触酶液。25~30℃酶解1~1.5小时,期间可晃动培养皿1~2次。4纯化:1)过滤:用双层漏斗将原生质体过滤到离心管中。2)纯化-漂浮法:用比原生质体比重大的20%蔗糖盐溶液经过离心后原生质体漂浮在蔗糖溶液的表面。(还有沉降法)2去下表皮:用镊子将下表皮撕掉,让叶肉细胞暴露,注意不要损伤细胞。过滤后的液体进行500rpm,3min离心,收集原生质体弃上清,沉淀用2ml8%甘露醇盐溶液轻轻悬浮在一新离心管中加入6~8ml的20%蔗糖盐溶液,将原生质体悬浮液轻轻环加在蔗糖盐溶液上面1000rpm,3min离心,漂浮原生质体原生质体在蔗糖溶液上面形成绿环,吸出原生质体置于另一离心管中再加入8%甘露醇盐溶液进行洗涤2~3次5镜检:将原生质体悬浮液滴在载玻片上,轻轻盖上盖玻片,先在低倍镜下找到原生质体,再换成高倍镜仔细观察。实验报告:1画出在显微镜下看到的原生质体的图像;2在整个实验操作过程中需要注意哪些问题?结果与讨论:1预期结果:完整的原生质体形态上是圆球状的,颜色鲜艳,富含细胞质。过滤前的酶解液过滤前的酶解液过滤前的酶解液2讨论:①选择合适的材料是实验成功的首要因素,请问该实验选材时注意什么问题?②酶解时酶液的组成及浓度如何确定?③研究原生质体的意义是什么?
本文标题:植物原生质体的分离与纯化
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