发酵产品---干扰素

发酵产品---干扰素干扰素概述1生产干扰素的菌种2发酵工艺过程3发酵过程控制4分离纯化过程5干扰素？干扰素的价值干扰素应用前景干扰素是一种细胞因子，是目前所知机体发挥抗病毒作用最快的第一病毒防御体系，具有广谱的抗病毒作用；抑制病毒感染、阻止病毒在体内扩散、促进痊愈；调节免疫功能；抑制肿瘤细胞生长等作用。干扰素应用前景重组人干扰素实现了干扰素在临床上的广泛应用，用于慢性乙型肝炎、丙型肝炎以及肾癌、黑色素瘤、血液系统疾病等的治疗。目前，国内主要生物制药企业正在积极研制长效重组人干扰素，重组人干扰素国内市场仍有广阔的发展空间，预计到2015年我国重组人干扰素市场规模将达到48亿元左右。干扰素概述1生产干扰素的菌种2发酵工艺过程3发酵过程控制4分离纯化过程5菌种来源:重组人干扰素α-2b工程菌是由带有人α-2b干扰素基因的重组质粒[pVG3]转化腐生型假单孢杆菌（pseudomonassputidaVG-4）菌种而来菌种的特性•细胞形态：革兰氏阴性，可运动，有荚膜，无芽孢，杆状•菌落特征：灰绿色半透明状。菌落之间结构相同，具有黏稠性•生化特性：菌株为苏氨酸营养缺陷型，可以利用L-缬氨酸、DL-精氨酸和L-苏氨酸作为碳源•遗传特性：细胞中携带pVG3质粒，对氨苄青霉素有抗性•生产能力：具有生产干扰素a-2b的能力干扰素概述1生产干扰素的菌种2发酵工艺过程3发酵过程控制4分离纯化过程5干扰素α-2b的发酵工艺过程：取保存工作种子批菌种，室温融化摇瓶培养：30℃，pH7.0，250r/min，18±2h检测：OD值和发酵液杂菌检查。1.接种：接入50L种子罐，接种量10%。2.培养：30℃，pH7.0。3.控制：级联调节通气量和搅拌转速4.DO为30%，3～4h，OD4.0。5.检测：显微镜和LB培养基划线检查，控制杂菌。1.接种：通入300L培养基的发酵罐，接种量10%。2.控制：级联调节通气量和搅拌转速。3.前4h：30℃，pH7.0，DO为30%。4.4h后：20℃，pH6.0，DO为60%，5～6.5h。5.终点控制：OD值达9.0±1.0，5℃冷却水快速降温至15℃以下。6.检测：发酵液杂菌检查连续流离心机：冷却的发酵液，16000r/min离心收集。菌体保存：－20℃冰柜，不超过12个月。检测：干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性。干扰素概述1生产干扰素的菌种2发酵工艺过程3发酵过程控制4分离纯化过程5•发酵中菌体生长与干扰素合成的关系•培养基组成•溶解氧•温度•pH值•发酵过程中泡沫的形成与控制(1)发酵中菌体生长与干扰素合成的关系在假单胞杆菌的发酵生产中，菌体在培养1.5h分裂速度最快，到3.5h开始下降。而干扰素的迅速合成出现在3.5h之后，在4h达到最大，然后由于降解而迅速下降。可见在发酵生产工艺中，假单胞杆菌的生长和干扰素的生产基本处于不相关状态。(2)培养基组成种子培养基的营养成分宜丰富些，尤其是氮源的含量应较高(即C/N低)。相反，对于发酵培养基，氮源含量应比种子培养基稍低(即C/N高)。(3)溶解氧基因工程菌发酵要求培养液中有足够的溶解氧，为了提高发酵罐的供氧能力，往往需要增大搅拌转速，增加空气流量，或通入纯氧(4)温度对于采用温度控制基因表达或质粒复制的基因工程菌。发酵过程一般分为生长和表达两个阶段。(5)pH值采用两段培养法，在生长和生产阶段分别控制在各自最佳pH值，对提高干扰素的发酵水平非常有利。可在发酵后期降低pH值，从而造成大量蛋白酶失活，减少干扰素的水解，提高干扰素的积累量。(6)发酵过程中泡沫的形成与控制气泡内的空气有隔热作用。造成培养及灭菌不彻底。泡沫多时会从排气口甚至从轴封中溢出容易造成染菌。一般应通过机械搅拌和加大少量表面活性剂来消除泡沫。干扰素概述1生产干扰素的菌种2发酵工艺过程3发酵过程控制4分离纯化过程5干扰素α-2b分离工艺过程菌体裂解预处理初级分离菌体裂解•裂解缓冲液：纯化水配制，2℃～10℃（pH7.5）•使用保护剂：EDTA，PMSF。•破碎-20℃菌体：2厘米以下的碎块•搅拌：加裂解缓冲液，2℃～10℃•冻融:细胞完全破裂，释放干扰素。预处理-沉淀•加絮凝剂聚乙烯亚胺:2℃～10℃，搅拌45min，对菌体碎片进行絮凝。•加凝聚剂醋酸钙溶液:2℃～10℃,搅拌15min，对菌体碎片、DNA等进行沉淀。预处理-离心离心：2℃～10℃，16000r/min收集上清液：含有重组干扰素蛋白质杂质沉淀：121℃、30min蒸汽灭菌,焚烧处理。初级分离盐析:加硫酸铵，2℃～10℃，搅匀,静置过夜。离心：连续流离心机，16000r/min保存：收集沉淀，粗干扰素，4℃保存。干扰素纯化工艺过程溶解粗干扰素沉淀除杂质疏水层析无菌过滤分装溶解粗干扰素•用超纯水配制纯化缓冲液。•在2～1O℃将粗干扰素倒入匀浆器中，加pH7.5磷酸缓冲液，匀浆，使之完全溶解。沉淀除杂质待粗干扰素完全溶解后，用磷酸将溶液调至pH5.0，进行蛋白质等电点沉淀疏水层析干扰素吸附在疏水层析柱中除去非疏水性蛋白洗脱与收集：0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）无菌过滤分装•0.22μm滤膜过滤干扰素溶液•分装•－20℃以下的冰箱中保存。