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第二节重组体导入受体细胞的原理与技术一、重组DNA导入大肠杆菌的方法二、重组DNA导入真核细胞的方法三、转化率及影响因素一、重组DNA导入大肠杆菌的方法相关概念1.转化(transformation)细菌获得外源质粒DNA,产生新的遗传性状的过程。2.转导(transduction)以噬菌体为媒介,将外源DNA导入细菌的过程。3.转染(transfection)指感受态的受体细胞捕获和表达以噬菌体为载体的重组DNA分子的过程。转导和转染的区别转导:通过λ噬菌体(病毒)颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA转移到受体细胞的过程。转染:λ噬菌体DNA分子直接导入受体细胞的过程。(一)转化(transformation)(1)热激法(heatshock)(2)电转化法(electronporation)(3)PEG介导的原生质体转化(4)接合转化一、重组DNA导入大肠杆菌的方法1、化学转化法感受态:细菌能从周围环境中吸收DNA的生理状态称为感受态(competence).感受态的出现是由于细菌表面出现许多DNA结合位点,这些位点只能与双链DNA结合,而不与单链DNA结合。这说明完整的双链结构对于转化活性来说是必要的。对于大肠杆菌细胞,一般采用CaCl2溶液来处理受体细胞,增加细胞膜的通透性,制备感受态细胞。一、重组DNA导入大肠杆菌的方法一、重组DNA导入大肠杆菌的方法细菌感受态细胞的制备过程培养大肠杆菌OD600至0.3-0.4Onice5-10min4℃离心收集菌用冰冷的60mMCaCl2重悬4℃离心收集菌4℃离心收集菌分装、-70℃冻存用冰冷的60mMCaCl2重悬Onice30min用冰冷的60mMCaCl2重悬一、重组DNA导入大肠杆菌的方法重组体导入受体细胞10ng载体DNA100L感受态菌Onice混合,静置30分钟37℃摇1小时10-100L转化液涂含抗菌素的平板吸附DNA摄入DNA加入1mLLB培养基42ºC1.5分钟热休克法简单,但转化效率不高(106-108/gDNA)。一、重组DNA导入大肠杆菌的方法平板培养基培养细菌10-100L转化液涂于含抗菌素的平板37℃过夜一、重组DNA导入大肠杆菌的方法2.电击转化法将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中,两极施加高压电场。在强大电场的作用下,细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙,质粒或DNA重组分子便可进入细胞内原理:用高压脉冲电流击破细胞膜或击成小孔,使各种大分子(包括DNA)通过这些小孔进入细胞.转化效率高(高于109/gDNA)一、重组DNA导入大肠杆菌的方法LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分钟,2℃离心集菌冰冷的水重悬菌体2℃离心集菌冰冷的水重悬菌体2℃离心收集菌体少量冰冷的水重悬分装成50-300L电转仪调为2.5kV,25F脉冲控制器200-4000.5g质粒DNAOnice混合加入1mLSOC培养液37℃中速震荡60分钟10-100L转化液涂含抗菌素的平板转化电击转化法(二)转导由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息的转移过程(三)转染噬菌体DNA不经过蛋白包装成病毒颗粒,直接被感受态细胞捕获的过程。与转化无本质区别体外包装好的重组噬菌体感染受体菌,形成噬菌斑。每gDNA能形成106个噬菌斑现在把DNA转移至动物细胞的过程也称转染体外包装过程二、重组DNA导入真核细胞(一)导入酵母细胞1.原生质体转化2.碱金属离子介导的完整细胞转化3.PEG1000转化法4.电击法(二)导入植物细胞(三)导入动物细胞1.利用原生质体进行转化酵母原生质体感受态酶去壁CaCl2PEG插入外源基因的载体转化转化细胞达原生质体总数的1%~2%,转化率受再生率影响共转化的原生质体占转化子总数的25%~33%酵母0.1mol/LLiCl处理感受态2.碱金属离子介导的完整细胞转化插入外源基因的载体40%PEG4000热激涂布选择性平板,筛选转化子吸收线性DNA能力明显大于环状DNA,两者相差80倍转化率:103个/gDNA;共转化现象极少4.电击转化(1)适于原生质体和完整细胞(2)转化率高,105个/gDNA(3)单链转化率高于双链3.PEG1000转化PEG处理酵母细胞,可获得类感受态,用于转化二、重组DNA导入真核细胞(一)导入酵母细胞1.载体介导的转化(农杆菌介导)2.DNA直接导入(基因抢法、电击法等)3.种质系统法(花粉管通道法等)(二)导入植物细胞(三)导入动物细胞(二)导入植物细胞1.农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法将目的基因插入到载体的T-DNA区,形成重组DNA(二)导入植物细胞1.农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法将重组DNA转入含有Vir致病基因的农杆菌(二)导入植物细胞1.农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法通过农杆菌侵染植物外植体(二)导入植物细胞1.农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法将含有外源目的基因的T-DNA整合到植物细胞基因组中,获得转基因植株在饲养平皿的滤纸上培养2天叶盘法的具体操作又称生物弹击法、微弹轰击法,借助高速金属微粒将DNA分子引入活细胞的转化技术。DNA1.2m钨弹头吸附金属微粒加速,进入受体细胞基因枪装入2.基因枪法(genegun)外植体制备轰击外植体培养及选择基因枪具体操作1.DNA微弹的制备2.外植体的制备3.DNA微弹轰击4.外植体的培养植物细胞原生质体纤维素酶和果胶酶DNA混合入电击缓冲液电击处理愈伤组织幼苗分化3.电击法(电穿孔法)选择培养二、重组DNA导入真核细胞(一)导入酵母细胞1.磷酸钙沉淀法2.脂质体介导法3.显微注射法4.DEAE-葡萄糖转染法(二)导入植物细胞(三)导入动物细胞原理:(三)导入动物细胞1.磷酸钙沉淀法通过磷酸钙-DNA共沉淀,将外源基因导入哺乳动物细胞依据不同的细胞类型,平皿上最多能有10%的细胞能吸收DNA沉淀。操作简便,成本低廉、可大批量转染、对细胞毒性小、效果稳定,但转染效率低。2.脂质体介导法脂质体包埋DNA,通过细胞膜进入细胞。脂质体(lipofectin)载体法应用玻璃显微注射器,直接把外源DNA注射到宿主细胞核里,使其整合到染色体上。3.显微注射法1)外源基因制备:线性化的质粒或目的片段2)收集受精卵:受孕后几小时内3)显微注射:将外源基因注入受精卵的雄原核4)受精卵移植显微注射法(microinjection)二乙氨乙基(DEAE)葡聚糖为多聚阳离子试剂,能促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。4.DEAE-葡萄糖转染法二乙氨乙基(DEAE)+++++++++++++++++++++++DNA-------------------二乙氨乙基(DEAE)+++++++++++++++++++++++葡聚糖葡聚糖DEAE-dextran外源DNA细胞混合DEAE-dextran对细胞有毒,常采用低浓度长时间处理吸附到细胞表面后被细胞吞入,部分DNA可以进入到细胞核里。4.DEAE-葡萄糖转染法导入外源DNA的几种方法三、转化率及影响因素转化率(cfu/μgDNA):每微克重组DNA转化后,接纳DNA分子的受体细胞的个数,即阳性克隆数。(一)转化率的计算:转化率=产生菌落的总数/DNA的加入量三、转化率及影响因素例:取1μl(0.1ng/μl)完整的质粒转化100μl的感受态细胞。向转化反应液中加入900μl培养液,让细菌恢复一小段时间,取100μl铺板。培养过夜,产生1000个菌落,转化率为多少?转化率=1000/0.01ngDNA=108cfu/μg三、转化率及影响因素例:某一DNA重组实验的重组率为20%,转化率为107cfu/mg天然载体,经酶切和连接处理后的重组载体转化率比天然载体约低100倍,欲获得104个重组克隆,需要投入多少重组载体DNA进行重组实验?104=107cfu/mg×10-2×a×20%重组载体a=0.5mg三、转化率及影响因素普通的亚克隆实验:1×106cfu/μgDNA;更复杂的亚克隆:1×107cfu/μgDNA,如有限量的DNA的转化,T-A克隆;构建文库:1×108cfu/μgDNA。1)载体DNA类型、大小;重组DNA浓度、纯度2)受体细胞3)转化方法:同一转化方法技术参数影响转化率(二)转化率的影响因素三、转化率及影响因素影响转化率的因素(2)感受态细胞(competentcells)①生长状态制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。②必须在冰冷的条件下制备。③CaCl2处理要充分,使细菌细胞膜失去一些蛋白。④储存感受态菌要在-70℃以下⑤使用感受态菌时必须迅速融化融化后一般不能再次冻存使用。
本文标题:第二节-重组体导入受体细胞的原理与技术
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