第三章-载体与宿主的选择

第三章基因工程载体及宿主第一节用于基因克隆的载体质粒（plasmid）噬菌体或病毒DNA考斯质粒（cosmid）与噬菌粒人造染色体载体载体的功能及特征真核细胞的克隆载体1载体的功能及特征载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件载体应具备的条件具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）具有合适的筛选标记具有较高的外源DNA的载装能力具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点2质粒2.1质粒的定义质粒（Plasmid）：细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常含抗生素抗性基因，是重组DNA技术中重要的工具。双螺旋共价闭合环（SC构型）开环双螺旋（OC构型）线状双螺旋（L构型）大肠杆菌的质粒主要有F质粒（大肠杆菌致育因子）、Col质粒（大肠杆菌素因子）、R质粒（抗药性因子）、降解质粒等。隐蔽性质粒多表型质粒2.2质粒的基本特征质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。质粒广泛存在于细菌细胞中，在霉菌、蓝藻、酵母和一些动植物细胞中也发现了质粒。绝大多数的质粒是DNA型的，少量线型或RNA质粒。绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA（covalentlyclosedcircularDNA）质粒DNA的分子量范围：1-300kb2.2.1质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒1-3拷贝（stringentplasmid）松弛型复制控制的质粒10-60拷贝（relaxedplasmid）不同类型质粒其本质是是否受宿主细胞不稳定的复制起始蛋白控制。即使是同一质粒，其拷贝数在不同的寄主细胞间和不同的生长环境也可能有很大的变化。目前公认的用于阐释质粒DNA复制控制机理的分子模型有两种：其一是自体阻遏蛋白质模型（autorepressormodel），其二是抑制蛋白质稀释模型（inhibitordilutionmodel）。前者的核心内容是，阻遏蛋白质的合成受负反馈（negativefeedback）机理调节，而且其浓度是恒定的。后者的关键论点是，阻遏蛋白质是组成型合成，其浓度同质粒的拷贝数成正比。（1）抑制蛋白质稀释模型它认为质粒DNA的复制，是受一种由质粒DNA编码的抑制蛋白质Cop调控的。细胞中Cop蛋白质的浓度是同质粒分子的拷贝数成正比，它抑制质粒DNA复制活性的作用方式有两种途径：一种是通过同质粒DNA的复制起点（oir）结合，直接地抑制质粒DNA的复制；另一种是通过阻断起始蛋白质Rep的合成，间接地抑制质粒DNA的合成。（2）自体阻遏蛋白质模型在抑制蛋白质稀释模型提出若干年之后，L.Sompayrac和O.Maaloe也提出了另外一种解释质粒DNA复制机理的自体阻遏蛋白质模型。这个模型对质粒DNA复制控制机理有两种解释：1.质粒DNA的复制是由一种叫做起始蛋白质Rep引发的。Rep蛋白质编码基因rep和自体阻遏蛋白质编码基因atr是属于同一个操纵子，它们共转录成同一个mRNA分子。自体阻遏蛋白质通过同启劝子-操纵基因区（P/O）的结合作用，调节质粒DNA的转录作用，以维持细胞中Arr和Rep蛋白质处于恒定的水平。而后，由Atr蛋白质调节产生的Rep蛋白质，则是通过同复制起点（ori）的结合，来引发质粒DNA的复制[图（a）]。2.Rep蛋白质是一种具有双重功能的蛋白质。它既具有自体阻遏蛋白质的功能，可同P/O区结合而抑制转录作用；同时又具有起始蛋白质的功能，能对复制起点（ori）发生作用，引发质粒DNA进行复制[图（b）]2.2.2质粒的不相容性任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质粒组成不相容性群。以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101、F、RP4拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容质粒的不相容性：分子机制两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内。2.2.3质粒的可转移性革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等非接合型质粒不能在天然条件下独立地发生接合作用如Col、R的其它成员值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由bom和mob基因决定.接合型质粒分子量大严紧型复制非接合型质粒分子量小松弛型复制在一般情况下，质粒的接合转移能力与分子大小及复制型间有一定的相关性。现归纳如下：2.2.4携带特殊的遗传标记野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物质抗性抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义2.3质粒DNA的分离纯化实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA：氯化铯密度梯度离心法质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染碱溶法质粒DNA纯度底、快速、操作简便沸水浴法质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间氯化铯密度梯度离心法：用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁加CsCl和溴乙锭超速离心过夜在紫外灯下吸取cccDNA稀释沉淀cccDNAproteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs碱溶法：用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁加NaOH和SDS的混合溶液，去膜释放内含物加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分蛋白质离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA用无DNase的RNase去除残余的RNAcccDNAL-DNAocDNAD-DNAT-DNA碱变性法质粒提取的原理：根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来的。在pH值12.0～12.5范围内时，线性的DNA会被变性而共价闭合环状质粒DNA却不会被变性。通过冷却或恢复中性pH值使之复性，线性染色体形成网状结构，而cccDNA可以准确迅速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质粒DNA。沸水浴法：用含有EDTA和TritonX-100的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁沸水浴40秒钟离心，用无菌牙签挑去沉淀物乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA2.4质粒的构建天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：pSC1018.8kb拷贝数5四环素抗性标记基因TcrColE16.5kb拷贝数20-30大肠杆菌内毒素标记基因E1RSF2124ColE1衍生质粒氨苄青霉素抗性标记基因Apr载体改造和构建的原则⑴去掉不必要的DNA区段。⑵减少限制酶的识别位点，一种酶只保留一个。（单一的限制性酶切位点）。⑶加入易于捡出的选择性标记基因。⑷对质粒进行安全性改造，要求质粒不能随便转移。⑸改造或增加基因表达的调控序列。2.5质粒的分类人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：高拷贝质粒突变拷贝数控制基因拷贝数1000-3000扩增基因低拷贝质粒来自pSC101拷贝数小于10表达某些毒性基因温敏质粒在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质测序质粒含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker整合质粒装有整合促进基因及位点便于外源基因的整合穿梭质粒装有针对两种不同受体的复制子便于基因克隆表达质粒装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件探针质粒装有报告基因便于启动子等元件的克隆筛选2.6重要的大肠杆菌质粒载体松弛型复制pBR3224363bpOriginofReplicationROPROISalIBamHITcrPvuIPstIPstIEcoRIClaIHindIIIHindIIBalIApr2.6.1pBR322质粒载体氯霉素可扩增拷贝数50-100/cell用于基因克隆P49-53pSC101pSE2124pMB1重要的大肠杆菌质粒载体2.6.2pUC18/19拷贝数2000-3000/cell用于基因克隆和测序装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记lacZ’BamHIpUC182686bpAprlacZ'oriGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT396452EcoRISstIKpnISmaIXbaISalIPstISphIHindIIIP53-54重要的大肠杆菌质粒载体pUC18/19：正选择标记lacZ’的显色原理pUC18/19PlaclacZ’MCSb-半乳糖苷酶的a-肽段abOHHHOHHOHHOHCH2OHONClBrClBrClBrONN5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-galIPTG（异丙基硫代半乳糖苷，与乳糖结构类似但不能被β-半乳糖苷酶降解）重要的大肠杆菌质粒载体2.6.3pGEM-3Z多拷贝装有两个噬菌体的强启动子装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记lacZ’用于外源基因的高效表达注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合2743bpMCSlacZ’PT7oriAprpGEM-3ZPSP6酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：E.coliBL21（DE3）等P55-56穿梭质粒载体：人工构建的具有2种不同复制起点和选择标记，在2种寄主内都能存活和复制，并可携带外源基因往返穿梭的质粒载体大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒载体如pBE2大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体如pPIC9K大肠杆菌-动物细胞穿梭质粒载体如pMT2p562.6.4穿梭质粒载体大肠杆菌-植物细胞穿梭质粒载体如Ti质粒3噬菌体或病毒DNA噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为：高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增3.1大肠杆菌的l噬菌体3.1.1l噬菌体的生物学特性：生物结构l噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体l噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成l-DNA全长48502个核苷酸l-DNA上至少有61个基因l噬菌体生物学特性：生物结构5’TCCAGCGGCGGGG3’3’CCCGCCGCTGGA5’COSCOScos头部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重组基因删除与整合基因l-DNAl噬菌体生物学特性：感染周期E.coli吸附LamB受体注入复制包装裂解l噬菌体生物学特性：感染周期体内包装100个左右的拷贝包装范围为原DNA的75-105%即36-51kbDAl噬菌体生物学特性：溶原状态l噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上