高效毛细管电泳思考题和答案解析

分离科学与技术复习思考题和答案-2-写在前面的话本试题的复习思考题与分离科学与技术上课用的课件相同步，为我认真的看了老师的课件和阅读了相关文献和结合自己的观点后，认真的总结完成了思考题的答案编写，试题仅供复习期末考试和考研复习用，答案要点均详细，需认真总结回答要点，在考试中，写出要点和适当作扩展即为正确答案，如你在阅读过程中，有任何疑问或者更好的答案，请发送邮件，我们再相互讨论，祝我们取得好成绩！第四章高效毛细管电泳复习思考题1、电泳分离的主要依据是什么？【问题分析】在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象称为电泳。【参考答案】电泳分离的主要依据是指带电离子在电场中定向移动时，不同离子具有不同的迁移速度。当带电离子以速度ν在电场中移动时，受到大小相等、方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用而实现分离。2、电泳分离中的电泳趟度指什么？影响电泳趟度的因素主要有哪些？【问题分析】电泳趟度又称为有效趟度，其计算式为：6qEe；而电渗淌度：EEOFEOF表2电泳趟度与电渗淌度类型定义主要影响因素电泳趟度单位电场强度下的电泳速度E:电场强度；V－毛细管柱两端施加的电压；L－毛细管柱的长度。电渗淌度单位电场强度下的电渗流速度与电场强度成正比，毛细管材料，溶液pH，温度，离子强度，添加剂。【参考答案】电泳趟度：单位电场强度下的电泳速度，影响电泳趟度的因素主要有：1）E:电场强度;；V－毛细管柱两端施加的电压；L－毛细管柱的长度。期末考试复习备考问题反馈：[e-mail]-3-3、某同学在进行毛细管电泳分析时，发现组分的迁移时间不能重现性。请帮他分析问题出现的可能原因有哪些？【问题分析】CE分析迁移时间的重现性受毛细管的使用时间、内表面的化学性质、使用前的预处理、所加电压、毛细管的柱温和运行缓冲溶液的组成等因素影响。CE分析中，被分析物的确定依据是所测得的迁移时间和电泳淌度值。以上因素很小的变化都会导致迁移时间很大的变化，通常以降低毛细管内焦耳热和管壁对溶质的吸附可提高分析的重现性。通过控制缓冲液的电导值可提高迁移时间的重现性。缓冲液变化影响毛细管壁上的硅羟基的电离，因此需选择合理的冲洗程序使硅羟基的电离达到平衡，以提高迁移时间的重现性。毛细管入口端缓冲液是影响溶质迁移行为的主要因素，其在电泳中发生的变化是影响电泳重现性的重要原因。目前在实验中可通过提高运行缓冲液的更换频率来保证迁移时间的重现性。提高迁移时间重现性的措施还有：控制柱温、选择进样方式、改良毛细管柱、添加内标物质、优化冲洗程序和缓冲液组成。【参考答案】问题出现的原因：1）毛细管内产生的焦耳热过高；2）毛细管壁对溶质产生了的吸附作用过强；3）近样方式不正确；4）没有提高运行缓冲溶液的更换频率；5）没有优化冲洗程度和缓冲液组成。4、什么是焦耳热？焦耳热的存在对毛细管电泳有什么影响？在毛细管电泳中，可以采取哪些方法降低焦耳热？【参考答案】焦耳热是指电流通过电泳介质而产生的热量；焦耳热的存在对毛细管电泳产生的影响：使电泳分离介质温度分布不均匀，引起溶液对流，从而导致区带展宽，降低分离效率。焦耳热随电压的升高而增大，柱内径是影响焦耳热的一个重要因素，内径越小，焦耳热的影响越小，缓冲溶液的浓度增加，焦耳热也越大，故可以采取降低焦耳热的措施有：使用较低的操作电压，采取尽可能小的柱内径、使用较低浓度的缓冲溶液和控制散热。5、高效毛细管电泳与高效液相色谱在分离方面有那些差异？【问题分析】高效毛细管电泳是以高压电场为驱动力，毛细管为载体（分离通道），依据样品中各组分之间迁移速度和分配行为的不同而实现分离的一类液相分离技术。高效液相色谱是用高压输送（最高输送压力可达4.5×107Pa）流动相（液体），用以特殊方法用小粒径填料（固定相）填充而成的色谱柱分离，同时柱后连有高灵敏度检测器，可对流出物进行连续检测的液相色谱。【参考答案】CE和HPLC相比,其相同处在于都是高效分离技术,操作均可自动化,且有多种不同分离模式。差异在于：1）CE用迁移时间取代HPLC中的保留时间，CE的分析时间通常不超过30min，比HPLC速度快；其他分离存在两相，电泳是均相。2）对CE而言，理论塔板高度和溶质的扩散系数成正比，对扩散系数小的生物大分子而言，分离科学与技术复习思考题和答案-4-其柱效高。3）CE所需样品体系为nL级，最低可达270fL，流动相用量也只需几毫升，而HPLC所需样品为μL级，流动相则需几百毫升乃至更，但CE仅能实现微量制备，而HPLC可作常量制备。6、简述与液相色谱相比，毛细管电泳具有高柱效和高检测灵敏度的原因。【问题分析】毛细管电泳(CE)又称高效毛细管电泳(HPCE)，是指以毛细管为分离室，以高压电场为驱动力的一类新型现代电泳技术。毛细管电泳引入高的电场强度，改善了分离质量，具有分离效率高、速度快和灵敏度高等特点，而且所需样品少、成本低，更为重要的是，它又是一种自动化的仪器分析方法。毛细管电泳法与高效液相色谱一样同是液相分离技术，在很大程度上两者互为补充，但无论从效率、速度、用量和成本来说，毛细管电泳法都显示了它独特的优势。毛细管电泳分离技术与传统的平板电泳和现代液相色谱分离技术相比具有很多优点：1.高效（105-107理论塔板数/米）；2.快速（几十秒至几十分钟）；3.分离模式多，选择自由度大；4.分析对象广，从无机离子到整个细胞；5.高速自动化；6.样品需量小，无环境污染，运行成本低。毛细管电泳的分离条件一般包括缓冲液、电渗控制、电场强度、温度、分离模式等。1)分离电压，一般在毛细管柱的长度确定时，随着分离电压的增加，电渗流和电泳速度的绝对值都将增加。迁移时间缩短。同时升高电压，毛细管电泳电流增加，产生的焦耳热增加，使溶液内部产生温度梯度，从而影响柱效。因此适宜的电压是毛细管电泳所必须的。2）电泳缓冲液：电泳分离过程是在缓冲液中进行的，缓冲液直接影响离子的迁移和最后的分离，甚至影响进样过程。选择缓冲液要遵循如下原则：（1）在所选择的pH范围内有很好的缓冲容量（2）较低的背景吸收（3）自身的淌度低，即分子体积大，电荷小，这样产生的焦耳热小，有利于提高柱效（4）只要条件允许，尽量采用酸性溶液，有利于获得较小的电渗流淌度和较大的分离度。缓冲液的浓度是一个很重要的指标，增加浓度，可以使离子强度增加，可以明显增加缓冲液的容量，减小溶质组分与毛细管内壁的相互作用，改变迁移时间，改善分离。但是当浓度增加时，毛细管电泳电流增加，焦耳热增加，影响分离度。添加剂：添加剂是CE中一个十分重要的控制因素，表面活性剂是使用最多的一种。表面活性剂均可用于毛细管区带电泳和毛细管胶速电动色谱中，前者的表面活性剂的浓度低于其临界胶速浓度，后者则相反。后者主要用作准固定相。常用的有SDS、十六烷基三甲基季氨溴、三羟基甲基氨基甲烷（Tris）、2-（吗啉）乙烷磺酸（MES）、甲基纤维素、PEG等。有机溶剂也可被广泛用作添加剂，不同有机溶剂的作用各不相同。有机溶剂的加入可以明显的减少电渗流速度，使分离度增加。它还可以增加有机样品的溶解度，改变选择性。常用的有甲醇、乙醇、乙腈、三氟乙酸酐等。4）温度：在CE中，温度的影响主要通过粘度体现出来，淌度是粘度的函数，因此温度的控制非常重要。【参考答案】因为1）毛细管电泳可通过改变操作模式和缓冲液成分，根据不同的分子性质(如大小、电荷数、疏水性等)对极广泛的物质进行有效分离，而高效液相色谱法要用价格昂贵的色谱柱和溶剂；2）采用了50~70m内径的毛细管和高达数万伏的电压；期末考试复习备考问题反馈：[e-mail]-5-3）毛细管的采用使产生的热量能够很快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以提高；4）柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块/米。5）毛细管电泳的电化学检测器允许使用微电极，有利于待测物质向电极表面的传递，当电极表面积减小时，可提高信噪比。7、在毛细管电泳中，如何提高分离柱效？【问题分析】影响CE的分离柱效的因素—区带展宽：1）进样的影响：当进样塞长度太大时，引起的峰展宽大于纵向扩散。分离效率明显下降；实际操作时进样塞长度小于或等于毛细管总长度的1%～2%。2）焦耳热与温度梯度的影响：散热过程中，在毛细管内形成温度梯度（中心温度高），破坏了塞流，导致区带展宽，改善方法为减小毛细管内径和控制散热；3）纵向扩散的影响：在HPCE中，纵向扩散引起的峰展宽：σ2=2Dt由扩散系数和迁移时间决定。大分子的扩散系数小，可获得更高的分离效率，这也是大分子生物试样分离的依据。4）溶质与管壁间的相互作用，存在吸附与疏水作用，造成谱带展宽，如，蛋白质、多肽带电荷数多，有较多的疏水基，吸附问题特别严重，是目前分离分析该类物质的一大难题。改善措施为：细内径毛细管柱，一方面有利于散热，另一方面比表面积大，又增加了溶质吸附的机会。【参考答案】提高毛细管分离柱效的方法：1）适宜的分离电压；2）适宜的分离温度；3）控制散热—降低焦耳热；4）应尽量选与试样淌度相匹配的背景电解质；5）进样塞长度小于或等于毛细管总长度的1%～2%。8、为什么在经典电泳不能使用高电压，而在毛细管电泳中可以使用高电压？【问题分析】经典电泳法的特点，电泳过程中焦耳热引起的热扩散与对流严重，只能使用低电压。HPCE相比于经典电泳在技术上采取的两项重要改进，采用了内径在25～100m的毛细管为分离通道，采用了高达数万伏的电压。【参考答案】经典电泳过程中焦耳热引起的热扩散与对流严重，只能使用低电压，而毛细管由于散热效率很高，可以减少因焦耳热效应造成的区带展宽，因而可以采用较高的电压，克服了传统电泳技术的局限，极大地提高分离效率，而且分离时间缩短，试样分析范围宽，检测限低，对于大分子的分离往往比色谱方法具有更高的柱效。9、在裸毛细管中进行自由溶液区带电泳分析时，阴离子与阳离子分析有什么区别？【问题分析】自由溶液区带电泳是根据带电粒子的荷质比的不同来进行分离的。电场作用下，毛细管柱中出现电泳现象和电渗流现象。带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和，中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；【参考答案】阳离子的分析：由于电泳和电渗流速度的运动方向一致，在负极最先分离科学与技术复习思考题和答案-6-流出；阴离子的分析：电泳和电渗两种效应的运动方向相反。当ν电渗流ν电泳时，阴离子在负极最后流出，在这种情况下，不但可以按类分离，除中性粒子外，同种类离子由于受到的电力大小不一样也同时被相互分离。10、在用毛细管电泳分析蛋白质时，可以采用哪些措施克服毛细管对蛋白质的吸附作用？【问题分析】吸附指的是毛细管壁对被分离物质粒子的作用，是由于阳离子溶质和带负电的管壁离子相互作用，疏水作用引起的，吸附作用与毛细管表面积与体积之比有关，内径越细，吸附越严重。【参考答案】对蛋白质而言，有较多的疏水基，吸附问题特别严重，减小毛细管对蛋白质的吸附作用的方法和途径：1）增加缓冲溶液浓度；2）加入两性离子物质代替强电解质，两性离子一端带正电，另一端带负电，带正电一端与管壁负电中心作用，浓度约为溶质的100-1000倍时，抑制对蛋白质吸附，又不增加溶液电导，对电渗流影响不大；3）在极端pH下电泳；4）对毛细管内壁改性。11、简述自由溶液毛细管区带电泳中常用添加剂的种类及其作用。【参考答案】见表9表9添加剂的种类及其作用种类作用实例表面活性剂增加疏水性溶质的水溶性，使毛细管内壁改性，使电渗流大小甚至方向改变。阴离子：SDS、SLS；阳离子：CTAB；非离子：Tween、Brij、TritonX-100手性选择试剂改变电渗流，增加疏水性溶质的水溶性与溶质相互作用形成配合质。各种CD及其衍生物、冠醚、手性表面活性剂、蛋白质、多糖、大环抗生素、立体选择性金属络合物（如Cu2+天冬氨酸络合物）等。有机溶剂调节介质的介电常数、粘度，从而改变电渗流速，增加疏水性溶质的溶解性能。甲醇、乙二醇等多醇