Western-Blot实战指南：从电泳到定量

因为教育科研是教育教学改革和发展的第一生产力。“科研兴数，科研兴校”，我时刻铭记心间。因而在自己的实际工作中自觉或不自觉地就进行了教育科学研究，下面就将自己在本学年中教育科研工作方面的情况总结【转】WesternBlot实战指南：从电泳到定量-1样品制备：变性条件——SDSLB直接裂解：用常温或者高温预热过（预热更有利于阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化，但容易遗忘，LB久煮某些性质会改变）的1*SDSLB（或者略高1.5*）直接加到细胞或者组织上并煮样。通常6孔板细胞80%以上密度，需200ul，其他按平板面积比类推。通常条件下，SDSLB都是过量的（因此不一定要严格参考SDSLB稀释比）；如果SDSLB不够，样品核酸、蛋白浓度过高时，煮样后会发现tip吸不上来，非常粘、一砣一砣的，很容易堵住tip。这时候常规做法有两种，1.再煮5min。常规煮样时间3-5min，样品过浓时就煮10min；2.如果10min煮样后，仍然吸不起来，才适当增加SDSLB，继续煮；也可以对样品进行超声。煮样时间若过长，蛋白会凝固，此时以失去继续WB的意义，请丢弃（判断标准：出现明显的蛋白沉淀和水分层）此方法的缺点，SDSLB煮过的样品如果用来做IP，需要特殊方法，因此，这种制备方法制备的样品有使用局限。非变性裂解法（不讨论诸如核抽提、亚细胞器分离等等了，其实类似）裂解细胞请尽量冰上操作，减缓酶解作用。俺前bossnature文章上的裂解液配方是：20mMTris/HCl,pH7.6,100mMNaCl,20mMKCl,1.5mMMgCl2,0.5%NP-40andproteaseinhibitors(20μg/mlleupeptin,10μg/mlpepstatinAand10μg/mlaprotinin)（此裂解液可用于抽提核蛋白），其中因为教育科研是教育教学改革和发展的第一生产力。“科研兴数，科研兴校”，我时刻铭记心间。因而在自己的实际工作中自觉或不自觉地就进行了教育科学研究，下面就将自己在本学年中教育科研工作方面的情况总结蛋白酶抑制剂很复杂也很贵，其实用0.5mMPMSF替代这三种就好了；如果还要做磷酸化蛋白，加1mMNa3VO4（现加现用），10mMNaF,1mMNa3VO4,50mMbeta-GP。此方法的优点：NaCl浓度略低于生理状态，保证裂解细胞的方式较为温和，便于随后的IP等试验。其他Na盐浓度的细胞裂解液也很常见，诸如0.15M（生理盐浓度）、0.3M、0.6M（高盐系列，裂解细胞时染色体会析出，细胞碎片和沉淀非常粘稠）及0.8-1.2M；0.3M及以下适合IP试验，0.6M及以上适合纯化蛋白，尤其相互作用较强的复合体，要得到纯化的一些复合体的组成蛋白一般采用极端的高盐裂解细胞。用于核蛋白的裂解的原因是0.5%NP-40，用于破坏核膜结构；可用到1%，但此时染色体会析出，沉淀粘稠。组织块裂解：组织块较大用匀浆的方法最合适，现在有不少转头很小的匀浆器。当组织超微量的时候，比如50mg新鲜癌组织，我采用的方法是1.低温（剪）搅碎，成肉糜状。2.锡箔纸包裹好，放入少量液氮，快速敲击（控制力量，尽量避免弄破锡箔纸），进一步破碎；反复多次。3.用上述细胞裂解液回收。分泌型蛋白富集：用无血清培养基培养细胞，收集上清液用于WB检测；如果含量过低，需要用TCA沉淀富集。因为教育科研是教育教学改革和发展的第一生产力。“科研兴数，科研兴校”，我时刻铭记心间。因而在自己的实际工作中自觉或不自觉地就进行了教育科学研究，下面就将自己在本学年中教育科研工作方面的情况总结理论上，从普通培养基中收集分泌蛋白，此时对细胞生长条件的影响最小，是最佳的实验条件；但是这存在隐忧。因为含血清的培养基中含有非常丰富的BSA（牛血清白蛋白）之类的蛋白质，除非你进一步分离纯化，否则直接用这种样品去WB会有非常大的麻烦，尤其当你的蛋白在60-46kDa之间的时候；用“任何”抗体去检测这一区间的蛋白，会有一片非常强的信号。因为此区间蛋白（主要是BSA）浓度过于富集，会非特异性粘附“任意”抗体，从而最终被识别。同理，采用SDSLB裂解细胞制备样品前，通常要用PBS洗涤，其目的之一是去除培养基中的BSA。采用无血清培养基收集细胞上清除了改变细胞的生理状态外（可能激活未知信号途径，诸如AKT等），还会出现的问题是：1.即使采用了无血清收集上清，仍然有大量杂蛋白，但相对好很多。2.选用了上清，由于蛋白浓度太稀，通常要采用TCA沉淀富集，再重新溶解。a.TCA沉淀对半定量操作要求非常高，因为很容易沉淀不充分或者离心操作丢失，尤其在离心过程，离心管的摆放非常讲究，要180度翻转离心两次。b。重新溶解时，由于蛋白需要在一定的盐离子条件下才能重新溶解，你要摸索充分溶解的条件，相对麻烦。实际上，如果你不是非常强调蛋白的分泌有什么生理功能，一般不建议检测上清，尤其半定量的WB实验检测不同样品间的差异。这里面有实验操作细节的麻烦——经验之谈，我曾经参与的cancercell文章所研究的蛋白就是分泌型蛋白，但90%的数据是celllysis；偶尔用到上清，也只是作为富集纯化该蛋白的原料，为进一步分析做准备。因为教育科研是教育教学改革和发展的第一生产力。“科研兴数，科研兴校”，我时刻铭记心间。因而在自己的实际工作中自觉或不自觉地就进行了教育科学研究，下面就将自己在本学年中教育科研工作方面的情况总结样品制备完，应立即低温保存（-20度短期（几天）；-80度长期；例外，IP用样品应直接进行IP，避免冻融破坏蛋白质间弱的相互作用）。SDSLB煮沸过的样品冻融会存在另一个问题，SDS沉淀；SDS4度就会沉淀，何况-80度。上样前应加热充分溶解，否则从加样口向下拖带（SDSLB不够，样品未充分溶解也会出现类似拖尾；上样过大也会）。在样品制备过程中，另一个需要注意的问题是，从样品制备的起始阶段就要注意定量问题；WB本身系统误差有20%，太细微的差别经常忽略不计。细胞样品可以先计数再接种，短时间内即使细胞生长有差异也不会对WB结果影响太多。组织样品，从肿瘤组织的大小（称重）开始，裂解液的体积都是精确定量的，操作过程也尽量避免蛋白损失。有人会说可以电泳前蛋白定量，我将下一节讨论蛋白定量的不科学性，以及裂解液成分对定量的干扰。蛋白电泳：电泳胶的制备、配方、缓冲液配方，请参考分子克隆。经验之谈，8%胶最底边约36KDa，10%最底边约25KDa，12%最底部约12KDa。8%胶可以跑300KDa-36KDa之间的任意蛋白，转膜效率对WB结果的的影响都问题不大。12%，180KDa左右，转膜效率对WB结果的影响都问题不大（300KDa蛋白如何，没有尝试过）。电泳一般采用恒流，45mA-55mA（应根据电泳仪器适当调整，要注意仪器最高限压；此条件适合gibcomodelV16型，胶宽20cm）。采用恒流的优点，保证最快速度完成电泳（电压会逐渐增大），省时且减少扩散；但是由于电泳速度过快因为教育科研是教育教学改革和发展的第一生产力。“科研兴数，科研兴校”，我时刻铭记心间。因而在自己的实际工作中自觉或不自觉地就进行了教育科学研究，下面就将自己在本学年中教育科研工作方面的情况总结时会发热而溶胶，所以你必须想办法散热。散热不好，条带出现波浪状。注意事项：1．聚丙烯酰胺的30%母液会降解，要4度避光保存。2．APS会失效，10%APS一般保质期才一个月左右。-20度分装长期保存。3．注意Trisbuff的PH值，以及平时所用的水的PH值。PH值改变会使带型非常怪异，所有蛋白和溴酚蓝压成一条细线（即便在分离胶中），如果溴酚蓝前有红色染料，那么此染料彗星式拖尾从溴酚蓝一直延伸到胶底部（溴酚蓝此时涌动极缓慢，位于胶中上部）4．上下层式电泳装置若漏液，哪边漏液，电泳条带往哪边倾斜。内外式电泳装置漏液，则装置处于短路状态，液体会过热。SDS-PAGE胶可能局部自溶，条带扭曲、变形。5．配胶用玻璃板和边条应及时洗净。玻板未洗净的坏处很多。尽管玻璃看似平滑，但是一些细微的凹陷处会凝结肉眼无法分辨的胶颗粒（摸上去疙疙瘩瘩），其坏处是，在该部位极易导致不均匀的胶块，样品经过该处或电泳散热不好，条带变形。如果是RNA的超薄胶，胶板的颗粒会导致局部巨大气泡，非常难于清除；蛋白胶也会导致一些小气泡的产生。玻板没洗净的另一个坏处是，由中学物理知识可知，玻璃表面越光滑粘附越牢，未洗净的玻板会削弱和胶体间的粘附力，拔梳子或边条时会产生微小的错动，胶体下部出现大量气泡（夹在玻板和胶之间，这个关系不大）；严重的错动会使上样时，样品从胶和玻璃之间的间隙漏光，或者甚至胶和玻板分开。为避免拔梳子时的错动，可在电泳缓冲液中拔梳子（比水更好，有SDS润滑）。判断玻板是否洗干净，用手摸一下有没有疙疙瘩瘩的；最好用洗洁精之类，洗衣因为教育科研是教育教学改革和发展的第一生产力。“科研兴数，科研兴校”，我时刻铭记心间。因而在自己的实际工作中自觉或不自觉地就进行了教育科学研究，下面就将自己在本学年中教育科研工作方面的情况总结粉、肥皂都不好用。6．上样时，不要把tip深入胶孔过深（或者采用细的尖端拉长的专用上样枪头），可能会错开胶和玻板，样品会泄露。7．未加样的孔应添加高浓度SDSLB平衡，否则最外侧条带会拉宽变形。通常20ul样品（含5ul4*SDSLB），可用8-8.5ul4*SDSLB平衡。同理，点marker的lane也要加入同样体积的LB。LB若在室温放置太久和新鲜的在比重上会有差异，在新旧LB靠近的地方，条带会拉宽或挤压变形。因此，同一块胶上，煮样及填空白所用LB应一致。LB应-20度保存。8．增加上样量不一定会提高荧光信号强度。增加上样量的后果通常只能是让你的内参粘连，所有的蛋白条带都扭曲变形。因为增加上样量最多只能提高几倍，而WB灵敏度是以10的几次幂量级的，所有目的蛋白信号的唯一方案就是IP富集（可特异提高目的蛋白浓度数百数千倍，并去除其它杂蛋白干扰）。增加上样量的另一个坏处是，本来高表达的蛋白，诸如内参，在同样WB条件下，可能出现荧光灼烧式粹灭（一晃而灭）或者条带中空。仍以6孔板80%以上汇合度为例，细胞裂解液和SDSLB通常都是投入200ul（最少80ul，这样面积的培养板如果裂解液投入太少，回收时的损失就太大，上样就很难做到一致），而这种浓度条件下制备的样品，电泳时上样量要控制在5-6ul，最少2.5ul，最多10ul，10ul时内参基本已经开始粘连成一条线，带型出现波浪纹；当然并非不可以多上样，再多对WB结果影响不大（没有的仍然没有），且条带都很丑。9.不同样品上样时，可考虑将样品体积调成一致或类似。如果一组IP样品和一组细胞裂解液样品，前者通常洗脱体积为15ul，刚好+5ul4*SDSLB达到常规20ul因为教育科研是教育教学改革和发展的第一生产力。“科研兴数，科研兴校”，我时刻铭记心间。因而在自己的实际工作中自觉或不自觉地就进行了教育科学研究，下面就将自己在本学年中教育科研工作方面的情况总结上样体积；后者第8点提到只上5ul，同样+5ulSDSLB（比重同，不会互相挤压），最好补加10ulDDW使总体积一致。通常这样不同条件获得的样品，中间最好用“空白”泳道隔开（空白仅指无蛋白，仍应加入8-8.5ul4*SDSLB），这样才能确保每条带都很美观。10.SDSPAGE胶配好暂时不用时，需用电泳缓冲液灌满空间（拔去梳子和底边边条后的间隙），用保鲜膜包裹防止液体蒸发，短期室温或稍长期4度保存。个人习惯为，灌好分离胶用饱和的正丁醇灌满上层，保鲜膜包裹，次日再灌堆积胶。两种方案都可以。所以如果预计次日工作量较大，可以提前灌好SDSPAGE。样品是否一定需要定量再上样？——不是的，这是浪费时间的一个操作。我们首先来讨论一下蛋白定量的科学性。蛋白定量首先需要一个参照系（标准蛋白），参照蛋白通常选择BSA，也就是说你所谓的定量是对应于BSA的浓度的一个参照值。这里面存在一个问题，即忽略了蛋白折叠和空间构象对光吸收、折射的影响；不同的蛋白折叠和构象还会影响颜料分子的