细胞衰老分子机理研究进展

1细胞衰老分子机理研究进展童坦君北京大学衰老研究中心北京大学基础医学院生化系2010Nov1210:00逸夫楼402室2生命科学永恒的主题————“衰老”—老年病百病之源。老年病发病率老年性痴呆（AD）65岁老人1/2085岁以上老人½人一生中医疗费2/3用于晚年？健康、长寿2000年（第五次）我国人口普查65岁老人=总人口10%约1.2亿65岁以上人口：7％14％法国需114年中国需27年（美国人口局，U.S.CensusBureau预测）3↓因老而衰：预防老年病造福个人与家庭节约社会财富解放生产力弄清衰老机理，可有的放矢,提出因应举措，提高延衰效能。老年病种类繁多（老年性痴呆,帕金森病等神经退行性疾病,老年糖尿病、骨质疏松、心、脑血管、呼吸等系统疾患,以及肿瘤……）表现有别发病各异4发达国家近年意识到衰老与老年病的研究可望收益和回报，纷纷改变理念，从福利观点，转到经济视角，既看到社会需求，也看到无限商机，加强研究投入。仅仅美国国会批准2005年度美国立衰老研究所（老年医学基础研究为主），一个所的预算，达10亿5千万美元。5如今，全球生命科学研究最热的三个领域是：衰老、肥胖和癌症，衰老在其中独占鳌头。人类对衰老的探究几乎从封建社会建立以来，就有所记载，然而，真正进入科学研究衰老的范畴，还是近20年的事。现在，国内外科学家对衰老的研究主要集中在哪些方面？从哪些角度进行研究？科学家都取得了怎样的成就？《生命世界》衰老的科学研究策划案03\30,2006《生命世界》中国科学院主管，中国科学院植物研究所、中国植物学会和高等教育出版社联合主办6各组织器官功能随年龄增加呈线型进行性下降406080100406080100功能百分比（％）年龄（年岁）神经传导速度心脏输出指数肾小球滤过速度最大呼吸容量0.4%0.8%1.0%1.1%人为什么会衰老？7统计资料表明：子女的寿命常与双亲的寿命有关；各种动物的最高寿限相当恒定。衰老进程由环境（外因）与遗传（内因）两大因素决定81992年世界卫生组织人的寿命决定因素遗传因素15%社会经济因素10%医疗服务技术8%气候因素7%生活习惯、卫生行为、精神面貌、保健意识等60%？？Theresultsofhumantwinstudiessuggestthatonly20-30%ofthevariationinsurvivaltoanageofabout85yearsisdeterminedbygeneticsA.M.Herskindetal.,HumGenet97,319,19969平均寿命主要与环境相关；物种最高寿限与遗传相关。不良环境可作用于遗传物质或其产物影响衰老进程。段建明等（DuanJM,etal.）IntlJBiochemCellBiol37(2005)1407–1420（基因对寿命的影响）•线虫(C.elegans)研究首次严格证明：单基因突变即可影响寿命。•clk基因与daf-2基因双突变，线虫寿命延长5倍。基因对衰老进程的主导性10人类“长寿基因的探索Puca,AA（ChildrensHosp）与Perls,Thomas（BostonUniv）等（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2001）报道：分析137组(308人)长寿同胞，百岁老人血样发现：四号染色体D4S1564(D代表DNA,D后的数字表示染色体号,s代表节段segment,s后的数字表示微卫星在染色体上的编号)位点与众不同，可能含有“长寿基因”。Perls：一年以后见分晓？？？11SebastianiP,etal.GeneticSignaturesofExceptionalLongevityinHumans.老寿星的遗传特征Science2010Jul21.[Epub]1055（centenarians）：1267（controls）分析结果：建立了以150SNPs(single-nucleotidepolymorphisms)为基础的分类模型。该模型用于另一组（百岁老人及其对照）：正确率77%。芯片分析显示：按差异SNP（或遗传特征）不同组合，可将90%的百岁老人分成19个群体。一种组合可能与某一老年病(e.g.,dementia,hypertension,andcardiovasculardisease)易感性有关，或可由此将健康老人的表型分成不同亚型。新英格兰百岁老人研究中心(NewEnglandCentenarianStudy)12老年医学基础是人口老龄化需求的前沿学科进行人类的衰老实验性研究,耗时费力,困难重重。用动物实验研究衰老，由于人与动物差别大，实验结果，只能借鉴，不能照搬。与细胞模型相互配合，可补动物实验之不足。衰老的实验性研究——成果累累13细胞生物的基本构成单位细胞衰老老年病发病的共同基础人成纤维细胞（人胚细胞可传60-70代，50岁成人细胞只能传10~20代）在体外培养可传代数，与供体年龄有关。供体年龄越大，传代越少。细胞衰老是个体衰老的微观模型，可部分体现个体衰老。理想状态：人类细胞衰老模型与动物实验相辅相成细胞衰老模型有非整体性与非生理性的局限性。如与动物整体实验相配合，可取长补短，相辅相成。14细胞衰老（CellSenescence）生物衰老的基本单位老年病发病的共同基础细胞衰老→老年退行性变→功能衰退增殖能力下降→细胞数减少→脏器萎缩细胞衰老是造成个体衰老的主要原因之一。15体外培养人类细胞衰老模型在研究人类衰老方面，具有不可取代的优点：１．无模式动物存在种族差异的缺点２．无人体实验取材难，操作难，周期长等缺点M.Kuro-o(Texas大学)“Cellsenescencehasbeensuggestedtobedirectlyrelatedtosenescenceoflivingorganism,includinghumans.”Cellular&MolecularLifeSciences57(2000):695-69716衰老机制复杂，单一的衰老相关指标难以准确、特异地评估衰老程度。组建一套定量的细胞衰老生物学年龄指征准确定量细胞衰老程度，可1、研究各种因素对衰老进程的影响2、检验药物抗衰作用，为中药现代化提供技术支撑。细胞衰老程度如何评估？17分子水平细胞衰老指征①端粒长度②细胞体外增殖能力③晚期糖基化终末产物④衰老相关ß-半乳糖苷酶活性⑤DNA损伤修复能力⑥DNA甲基化程度⑦线粒体DNA片段缺失18①我国端粒与人类细胞衰老相关性的研究端粒长度：人类体细胞的计时器。每增加1代龄，端粒长度减少约49bp。中国人外周血淋巴细胞的端粒长度每年平均缩短35bp。(张宗玉等，生物化学杂志,1995)SouthernblotsTelomerelengths+细胞越老，端粒越短，电泳时跑得越快1905101520010203040506070代龄（PDL）A490nmE-03/hour人胚成纤维细胞体外培养代龄与细胞增殖速度的关系②细胞的体外增殖能力广泛应用于衰老研究。GrowthcurvesMTTassay20人胚肺二倍体成纤维细胞(绿色者为衰老细胞)③衰老相关β半乳糖苷酶活性衰老细胞年轻细胞SA--βgalstaining21④DNA损伤修复能力随增龄而下降损伤前损伤修复年轻细胞衰老细胞损伤前损伤修复cometassay彗星试验（单细胞凝胶电泳）尾长(μm)；尾面积/总面积(%)尾越长，%越高，损伤越重22012345678020406080代龄（PDL）Fluorescence/mgprotein⑤晚期糖基化终末产物蛋白质糖基化与大分子交联，逐渐脱水，形成的一种具有黄棕色荧光的产物。DeterminationofAGE(AdvancedGlycationEndproduct)23从分子水平组建一套为国际所承认的细胞衰老生物学指征。我室在国外刊物的部分相关论文：DuanJM,IntJBiochemCellBiol,2005,37:1407-1420ZhengWJ,etal.JBiolChem2004,279:31524-31532GuoSZ,etal.ExpCellRes2004,298:465-472HuangY,etal.JCellPhysiol,2004,201:483-491.ZhangXW,etal.Oncogene2003,22:2405-2416WangPC,etal.MechAgeDev2003,124:1025-1034DuanJM,etal.JBiolChem2001276:48325-48331.LiJH,etal.MechAgeDev1995,80:25-34.TangZQ,etal.MechAgeDev1994,73:57-67.基因水平细胞衰老指征？？241.5%1.0%0.5%-0.5%-1.0%-1.5%2.0倍2.5倍3.0倍用cDNA芯片检测人二倍体成纤维细胞衰老基因表达谱的变化HGEC-40S:含4096条人类基因，衰老表达差异较大的基因有117种。25细胞衰老的基因表达谱研究衰老细胞与年轻细胞基因（4096条）芯片杂交信号强度散点图α-2-巨球蛋白在4096条人类基因的cDNA微阵列表达谱中发现年轻和衰老细胞中表达变化在5倍以上的基因有6种。其中α-2-巨球蛋白基因不仅在衰老的成纤维细胞表达明显增高，在年轻细胞中的表达水平亦较其它5种基因高，易检出，易定量。青老26衰老过程中基因表达谱的变化4096种中表达变化幅度2.5倍的基因46种。下调的基因：参与细胞周期的基因等。上调的基因：细胞外基质有关基因等。挑选表达变化大的基因，以RT-PCR技术对其再检测。27衰老时表达下降的4种基因前脑啡肽原（Preproenkaphalin）00.10.20.30.40.50.60.7020406080PDLArbitaryunit(PPE/b-actin)有丝分裂检控点蛋白（Mad2）00.20.40.60.8020406080PDLArbitaryunit(Mad2/B-actin)双泛素（Diubiquitin）00.20.40.60.81020406080PDLArbitaryunit(Diubiquitin/B-actin)钾离子通道（TPKC1）00.20.40.60.8020406080PDLArbitaryunit(TPKC1/B-actin)28衰老时表达增强的5种基因层粘连蛋白Lamininα4亚基00.20.40.60.81020406080PDLArbitaryunit(Laminina4/b-actin)HLH碱性磷蛋白G0S800.20.40.60.811.2020406080PDLArbitaryunit(GOS8/b-actin)硒蛋白P（SelenoproteinP）00.511.5020406080PDLArbitaryunit(SelenoproteinP/B-actin)血管细胞粘附分子1（VCAM1）00.20.40.60.81020406080PDLArbitaryunit(VCAM1/B-actin)2巨球蛋白基因α-2-M00.20.40.60.811.21.41.61.8020406080PDLArbitaryunit(A-2-M/B-actin)优选29衰老过程中α-2-巨球蛋白、p16Ink4a和p21Waf1基因表达与代龄关系00.20.40.60.811.2020406080PDLArbitaryunit(p21/b-actin)α-2-巨球蛋白p16Ink4ap21Waf1将α-2-巨球蛋白，与众所公认的细胞衰老时表达增强的基因p16Ink4a及p21Waf1相比较，从中选出最适合作为衰老标志物的基因．30Northernblot检测2BS细胞衰老过程中α-2-巨球蛋白（alpha-2-macroglobulin,α2M）的基因表达情况GAPDHα2M代龄28425262•细胞衰老标志基因的选定31结论：α-2-巨球蛋白基因表达，与体外培养