数字PCR

数字PCR（DigitalPCR）殷海月2150464DigitalPCRDigitalPCR-发展历史DigitalPCR-技术原理DigitalPCR-应用前景DigitalPCR-分类优点DigitalPCR什么是DigitalPCR？数字PCR本质上是把弱信号从噪音信号中“拎”出来。DigitalPCR技术原理数字PCR一般包括两部分内容,即PCR扩增和荧光信号分析。在PCR扩增阶段,数字PCR先将样品稀释到单分子水平,再平均分配到几十至几万个单元中进行反应。与qPCR对每个循环进行实时荧光测定的方法不同,数字PCR是在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集,有荧光信号记为1,无荧光信号记为0,有荧光信号的反应单元中至少包含一个拷贝的。DigitalPCR技术原理DigitalPCR技术原理在通常情况下,数字PCR的反应单元中可能包含两个或两个以上的目标分子,这时需要采用泊松概率分布公式(Poissondistribution)进行计算上式中λ为每个反应单元中所含目标DNA分子的平均拷贝数(浓度),p为在一定的λ条件下,每个反应单元中所含k个拷贝目标DNA分子的概率。λ由样品的稀释倍数m决定,有λ=cm,其中c为样品的原始拷贝数(浓度)。当k=0(不含目标DNA分子)时,上式可简化为p=e－λ=e－cm,p可以看作是无荧光信号的反应单元数与反应单元总数的比值,即其中,n为反应单元总数,f为有荧光信号的反应单元数。上式两边取对数(ln)得到，根据数字PCR反应单元总数和有荧光信号的单元数以及样品的稀释倍系数,就可以得到样本的最初拷贝数(浓度)。DigitalPCR最初Vogelstein等提出的数字PCR是在96孔板中进行的。DNA模板被稀释成大约平均每两个孔内有一个拷贝的浓度，在经过优化的实验条件下进行PCR扩增。DigitalPCR94℃1min94℃15s55℃15s70℃15s70℃5min60循环PCR扩增他们设计了两种带有不同荧光基团的分子信标探针分别与PCR产物杂交，其中一种探针可以与野生型和突变型两种产物杂交，另一种探针只与野生型杂交，通过直接计数每个孔内的荧光信号得到同一样品中等位基因(或野生型与突变型)的数目和比值，并利用统计学方法分析样品间的显著性差异。FIG.2.DiscriminationbetweenWTandmutantPCRproductsbyMBs.SeparatePCRproducts(n=10),eachgeneratedfrom50genomeequivalentsofDNAofcolorectaltumorcellscontainingtheindicatedmutationsofc-Ki-Ras,wereanalyzedwiththeMBprobesdescribedabove.RepresentativeexamplesofthePCRproductsusedforMBanalysiswerepurifiedandsequenceddirectly.DigitalPCRKinzler和Vogelstein检测和量化直肠癌患者粪便样品中的K-RAS突变，因此将基因组DNA稀释并等分至384孔微量滴定板的各个孔中，这样整个板就代表了单个样品。他们随后扩增了包含所寻找的突变热点的基因区域。DigitalPCR发展历史1992年，Sykes等报道了基于样品稀释和泊松分布数据处理的巢式PCR定量技术，并提出了数字PCR的构想。1997年Kalinina,、BrownJ,和SilverJ使用纳升级芯片进行单克隆模板PCR扩增，获得了美国专利，更重要的是这种采用“电浸润法”进行纳升级芯片制造技术显露雏形。1999年,Vogelstein和Kinzler首次提出了数字PCR。2003年Dressman等发明了一种BEAMing方法(珠子、乳剂、扩增与磁力)BEAMing将模板、引物、PCR试剂和磁珠的混合物分至小滴中，其中大多数的小滴不含有或只含有一个模板。PCR完成后，其中扩增产物会通过生物素——链酶亲和素的键合关联在磁珠上，乳化物随之会被打散，珠子就能通过与检测寡核苷酸和流式细胞仪的杂交物所读取。DigitalPCR发展历史2006年Fluidigm公司推出了第一台基于芯片的商品化数字PCR系统.QuantaLife利用油包水微滴生成技术开发了微滴式数字PCR技术.2011年，QuantaLife公司被Bio-Rad公司收购，其微滴式数字PCR仪产品更名为QX100型号仪,2013年该公司又推出了升级型号QX200.2013年下半年，Life-technologies推出了QuantStudio3D数字PCR系统DigitalPCR分类微反应室/孔板数字PCR早期的数字PCR技术采用96/384孔板作为反应单元。但是数字PCR技术的灵敏度取决于反应单元的总数,反应单元数越多越有利于提高灵敏度和准确度,普通的96/384孔板无法满足检测的需要。因此,出现了成倍提高反应单元数目的做法,反应体积从微升降至纳升级。DigitalPCR分类微流控芯片数字PCR微流控芯片技术的使用使数字PCR能够快速并准确地将样品流体分成若干个独立的单元,进行多步平行反应、成本低、体积小和高通量,是理想的数字PCR平台。目前Fluidigm公司的Bio-MarkTM基因分析系统，LifeTechnologies公司QuantStudioTM3D数字PCR系统均均为采用微流控芯片技术的数字PCR系统。DigitalPCR--QuantStudioTM3D数字可获得兼具高精确度和高敏感度的绝对定量数据—可以进行单分子监测和计数。工作流程简单—基于芯片的工作流程。只需载入芯片并运行即可获得数据。经济的处理平台—以较低的采购和运行成本立即开展数字PCR。兼容性强—使用您的现有TaqMan®Assay方法即可获得数字化结果。密封的系统—通过密封芯片隔绝任污染物，无需转移步骤，避免样品暴露。宽动态范围—可实现5Log的动态范围。直观—可在仪器触摸屏上直接看到数据，也可以轻松地将数据转移到计算机上，采用AnalysisSuite™数字PCR软件进行分析。DigitalPCR分类液滴数字PCR液滴数字PCR源于乳液PCR(emulsionPCR)技术，利用微滴发生器可以一次生成数万乃至数百万个纳升甚至皮升级别的单个油包水微滴,作为数字PCR的样品分散载体。PCR反应结束后检测每个微滴的荧光信号。目前Bio-Rad公司的QX100系统、QX200系统均为采用液滴技术的数字PCR系统。DigitalPCR分类之BIO-RAD液滴式数字PCRDigitalPCR之BIO-RAD液滴式数字PCRDigitalPCR分类之BIO-RAD液滴式数字PCRDigitalPCR分类之BIO-RAD液滴式数字PCRDigitalPCR优点qPCRdPCR每个循环进行实时荧光测定扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集样品的PCR扩增效率可能与校准物的扩增效率不同直接计数目标分子数而不依靠任何校准物或外标低拷贝数的目标DNA分子不能通过扩增检测到单DNA模板出现在反应室而未被检出可能性非常低qPCR主要依赖于校准物制备的标准曲线，进而确定未知样品的浓度，是相对定量的方法通过计数单个分子从而实现绝对定量DigitalPCR应用产前诊断1997年卢煜明教授课题组发现孕妇血浆中的胎儿游离核酸(DNA和RNA)检测开启了无创产前诊断的新领域，补充了唐氏综合症(非侵入性染色体异倍体)产前诊断方法。检测孕妇血液中完全来自胎儿的PLAC4mRNA上的SNP位点(rs8130833)的比例(digital-RNA-SNP法)，以及检测血液中21号染色体与1号染色体的相对含量(digitalRCD法)，可检测血液中25%的胎儿基因。DigitalPCR应用二代测序下一代测序(nextgenerationsequencing,NGS)需要通过测序校正分子数量，文库制备需要微克级的样本核酸，对样本量要求较高。dPCR实现了测序文库的绝对定量，消除了构建和PCR定量标准曲线等不确定因素，相对标准偏差低于10%，在无滴定情况下，足够满足直接测序的精度要求。DigitalPCR应用肿瘤早期研究1、检测稀有突变：以dPCR法来检测肺癌患者痰液中基因的突变，使用dPCR在EGFＲ突变患者中有30%－50%可以在痰液中检测出EGFR（表面生长因子）突变，这与在血液中检出率相似，表明使用dPCR对痰液的检测可代替某些病人的活检，dPCR还应用于通过其他体液，以非侵入性的方式诊断肿瘤。DigitalPCR应用2、miRNA精确定量miRNA是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，他们参与调节细胞功能，并且稳定的存在于外周循环，可发展为癌症早期检测的生物标志物。dPCR可以用于血液样品miRNA的分析测试。DigitalPCR应用3、拷贝数变异研究拷贝数变异(copynumbervariations，CNVs)是指基因组的缺失，扩增和易位，长度从数百到数百万个碱基对不等，可能导致疾病的易感性。使用dPCR目标基因被确定后，用限制性内切酶来分离目标基因，每个模板稀释到独立的微滴然后分别计数，可以获得极高的精度。拷贝数变异对肿瘤的发生发展起着一定的作用，有研究对乳腺癌的拷贝数变异和易感性的关系进行报道，总共分析了7个相关CNVs，DigitalPCR应用环境微生物方向快速诊断细菌，由于dPCR灵敏度更高，因此不经细菌培养就可对样品直接进行鉴定。采用多种细菌的通用引物进行多重PCR分析，还可提高通量，节约成本，实现快速诊断。DigitalPCR应用多重PCR实现快速诊断在对突发或不明原因感染进行确诊时，需对样本进行大规模选择性地筛查，如在同一反应体系中进行多重反应和定量多种目的片段，在保证荧光信号强度与探针浓度成正比的前提下，调整荧光素的浓度以及调整两种荧光素混合时的配比，可以在一个反应中达到多至10重的分析。DigitalPCR前景dPCR目前主要用于原癌基因的等位基因突变、微小RNA分析和拷贝数变异，其在传染病领域也有广阔的应用前景，在病原学诊断、抗病毒治疗监测、预后判断等方面具有重要意义。许多公司正在研发一步法试剂盒，或者在芯片中整合反转录反应，能够直接特异检测RNA分子，将拓宽其在传染病临床诊断和基因表达研究中的应用。dPCR正朝着高通量、低成本、低样本损耗的方向发展，或将成为基础研究和临床诊断领域的主流技术。参考文献1VogelsteinB,KinzlerKW.DigitalPCR.[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,1999,96(16):9236-9241.2李亮,隋志伟,王晶,等.基于数字PCR的单分子DNA定量技术研究进展[J].生物化学与生物物理进展,2012,10期(10):1017-1023.3李春勇.数字PCR技术原理及应用[J].生物技术世界,2014,(11):10-13.4JeffreyM.Perkel,高大海,姜天海.数字PCR革命[J].科学新闻,2014,(08):72-75.5IsaacK,JianW,NickP,etal.Detectionandquantificationofraremutationswithmassivelyparallelsequencing.[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2011,108(23):9530-9535.参考文献6WangP,JingF,LiG,etal.AbsolutequantificationoflungCancerrelatedmicroRNAbydropletdigitalPCR[J].Biosensors&Bioelectronics,2015,74:836-84