酶生物传感器

1㈡酶的基本特征●酶的高效催化性酶的催化效率通常比一般催化剂高106-1012倍。酶之所以能高效催化，是通过降低反应所需的活化能实现的。2●酶的高度特异性酶不仅具有一般催化剂加快反应速度的作用，而且具有高度的特异性。绝对特异性相对特异性立体异构特异性3㈢酶促反应动力学酶促反应动力学是研究酶反应速度及各种因素对酶反应速度影响的科学。主要影响因素包括有：底物浓度、酶浓度、pH值、温度、抑制剂与激活剂等。4酶动力学测定的是初速度，是指酶在反应过程中底物初始浓度被消耗在5%以内的速度。目的是排除酶反应过程中出现的各种干扰因素，以便测得准确的酶反应速度。5⑴底物浓度对酶促反应速度的影响6⑵酶浓度对酶促反应速度的影响若底物初始浓度固定时，酶反应速度与酶浓度呈线性关系。7⑶温度对酶促反应速度的影响每一种酶的催化反应都有适宜的温度范围和最适温度。8⑷pH对酶促反应速度的影响每一种酶都有适宜的pH值范围和最适pH值。在一定的pH下，酶促反应具有最高的反应速度，此pH称为该酶的最适pH。910⑸抑制剂、激活剂对酶促反应速度的影响凡能降低酶的活性甚至使酶完全失活的物质称为抑制剂，抑制剂的种类很多，包括药物、抗生素、毒物、抗代谢物以及酶促反应产物等。11凡能激活酶活性的物质，均称激活剂。某些酶必须有激活剂存在，才能进行酶促反应。激活剂大部分为某些无机离子，也有一些有机分子。12二、酶传感器酶传感器是应用固定化酶作为敏感元件与各种信号转换器组合而成的生物传感器。依据信号转换器的类型，酶传感器大致可分为酶电极、酶场效应管传感器、酶热敏电阻传感器、酶压电晶体型、光纤光学型等。13传感器的类型144.1酶电极传感器Enzymeelectrodesensor酶电极是由固定化酶与电流型电极或电位型电极组合而成的生物传感器。具有酶的分子识别和选择催化功能，又有电化学电极响应快、操作简便的特点，能快速测定试液中某一给定化合物的浓度，且需很少量的样品。15㈠电流型酶电极电流型酶电极是将酶促反应产生的物质在电极上发生氧化或还原反应产生的电流作为测量信号，在一定条件下，利用测得的电流信号与被测物活度或浓度的函数关系，来测定样品中某一生物组分的活度或浓度。16制作生物传感器最常用的是氧化酶：底物+O2产物+H2O217基础电极可采用氧、过氧化氢电极，还可采用近年开发的介体修饰的炭、铂、钯和金等固体电极或介体修饰电极。18氧电极：是一个通过测定电解电流来测定溶液中氧含量的电解池。工作时，在铂阴极和Ag阳极之间施加0.6V的电压。当E=-0.2V时电极开始电解，产生还原电流，其还原反应式为：22244OHOeOH使用最多的是封闭式的Clark氧电极20铂电极与Ag电极组合在一起置于参比溶液中，与被测溶液之间用透氧膜隔开。被测溶液中的溶解氧通过膜扩散到电解质溶液薄层，再扩散到铂电极表面进行还原产生电流。H2O2电极H2O2电极基本测量电路和电压-电流曲线两极间外加一定电压，实际测量时，外加电压控制在电压-电流曲线的平滑部分，即0.7-0.9V，此时输出电流就与浓度成比例。阳极反应阴极反应22222HOOHe221222eHOHO23241.葡萄糖传感器葡萄糖传感器是研究最早、开发最成熟并已市场化的生物传感器，即血糖仪。各种型号的血糖仪产品25（1）早期的葡萄糖传感器早期的葡萄糖传感器是由葡萄糖氧化酶膜和电化学电极组成的。在电化学电极的透气膜上固定葡萄糖氧化酶。26当葡萄糖溶液与酶膜接触时，发生如下反应：61262261272222CHOHOOCHOHO葡萄糖氧化酶27故葡萄糖浓度测试方法有三种：生成的葡萄糖酸消耗的氧生成的H2O261262261272222CHOHOOCHOHO葡萄糖氧化酶28测量葡萄糖酸的葡萄糖传感器：pH电极和离子敏场效应管测定葡萄糖酸的量来计算样品中葡萄糖的含量，最低检测限为10-3mol／L，灵敏度较低；测量氧消耗量的葡萄糖传感器：29Clark氧电极用于测定酶促反应中氧的消耗量(电流降低的量)来计算样品中葡萄糖的含量，最低检测限为10-4mol／L。22244OHOeOH30葡萄糖氧化产生H2O2，H2O2通过选择性透气膜，在Pt电极上氧化，葡萄糖的含量与生成的电流成正比，由此可测出葡萄糖的浓度。检测H2O2的方法的本底电流小，灵敏度高，其最低检出限为10-8mol／L。测量H2O2生成量的葡萄糖传感器：22222HOOHe31（2）改进的葡萄糖传感器为消除环境中氧对测定的干扰，用四硫富瓦烯、二茂铁等容易在电极上氧化还原的介体来代替氧的电子传递作用。电子介体是酶氧化还原活性中心与电极表面之间的电子传递中介物，在电流型酶电极中起着关键性作用。各种电子传递介体的使用，使得电流型酶传感器的响应速度、检测灵敏度和选择性都得到了很大的提高。32方法：将葡萄糖氧化酶和电子介体同时包埋于聚合物膜中，或直接修饰于电极的表面构成葡萄糖酶传感器。33在葡萄糖氧化酶（）的催化下，葡萄糖被氧化为葡萄糖酸，再由二茂铁离子将还原型葡萄糖氧化酶（）氧化为氧化型葡萄糖氧化酶（），然后二茂铁在电极上氧化成二茂铁离子，通过二茂铁在电极上产生的氧化电流来实现葡萄糖含量的检测。GOXGODGOX34介体传感器的特点：•仅用较低的电压就能使介体氧化。•传感器对氧不敏感，能在缺氧和氧浓度变化的条件下使用。•二茂铁离子与还原GOD之间的电子传递快，电极响应迅速。35采用场效应晶体管和微电极做换能器，以缩小传感器的体积；利用电子技术、改善信号放大和显示方法，使其易于商品化；改善采样方法，使患者使用方便或更易于临床应用。最重要的改进是使用化学电子传递中间介体代替作为自然电子受体的氧，使酶催化反应不再受到溶解氧含量的制约。36（3）血糖仪测试片血糖仪测试片37手表式的葡萄糖传感器39手表式无创血糖仪是近年来出现的一种无创、无痛，能连续测定血糖的设备。它通过电化学传感器和电渗透原理来检测皮下组织液中的葡萄糖浓度，无需针刺采血。手表式血糖仪测定的是组织间液葡萄糖值，因此要略滞后于指血血糖值。40(2)乳酸电极血液中乳酸的浓度是反映人体体力消耗程度的重要指标。在体育运动训练中乳酸的检验是极为必要，国际上乳酸传感器已经有成熟的商品仪器。42还可采用介体修饰的方法制备乳酸传感器。在电极上滴介体四硫富瓦烯(TTF)浆液，晾干后，将乳酸氧化酶固定在该电极表面修饰层上面，即构成乳酸传感器。4344在乳酸氧化酶的催化下，乳酸被氧化为丙酮酸，再由四硫富瓦烯离子将还原型乳酸氧化酶氧化为氧化型乳酸氧化酶，然后四硫富瓦烯在电极上氧化成四硫富瓦烯离子，通过四硫富瓦烯在电极上产生的氧化电流来实现乳酸含量的检测。45(3)胆固醇电极胆固醇电极是一种用于临床测定血清胆固醇含量的电流型酶传感器。血液中胆固醇约有2／3以酯型存在，1／3以游离型存在。自然界中的胆固醇主要存在于动物性食物之中，植物中没有胆固醇。兽肉的胆固醇含量高于禽肉，肥肉高于瘦肉，贝壳类和软体类高于一般鱼类，蛋黄、鱼子、动物内脏的胆固醇含量非常高。降低胆固醇的食物：§含膳食纤维丰富的食物§VC与VE§饮酒可能使血中的高密度脂蛋白升高，加强防治高胆固醇血症的作用。葡萄酒较合适，但必须严格限制摄入量。48胆固醇电极是一种用于临床测定血清胆固醇含量的电流型酶传感器。2HORCOOH胆固醇脂酶胆固醇游离胆固醇222OHO胆固醇氧化酶游离胆固醇胆甾烯酮结合型酶电极49根据反应过程中消耗的氧，产生的过氧化氢，用相应的电极组成胆固醇传感器测定电流的变化量，在一定条件下，电流变化量与胆固醇浓度呈线性相关。50(4）肌酸和肌酸酐电极脱水肌酸肌酸酐血清肌酸肝含量测定是衡量肾功能的一个很好的基准。血清肌酸酐浓度不会因食物的种类而受影响，所以做为判断肾脏机能的依据较血清尿素可靠。血清肌酸酐浓度与肌肉的量有关，因此肌肉多的排放的尿肌酸酐浓度会比肌肉少的多。52222222+HOHOHOOHCHOHO肌酸酐水解酶脒基肌酸水解酶肌氨酸氧化酶肌酸酐肌酸肌酸肌氨酸脲肌氨酸甘氨酸53肌酸和肌酸酐微传感器54（5）磷酸盐电极佝偻病软骨病55葡萄糖-6-磷酸盐葡萄糖+磷酸酸性磷酸酯酶葡萄糖+O2葡萄糖酸+H2O2葡萄糖氧化酶56（6）淀粉电极淀粉葡萄糖淀粉酶葡萄糖+O2葡萄糖酸+H2O2葡萄糖氧化酶57（7）乙醇电极CH3CH2OH♫可用乙醇来制造醋酸、饮料、香精、染料、燃料等。♫医疗上也常用体积分数为70-75%的乙醇作消毒剂等。酒后驾驶饮酒驾车：指驾驶员血液中的酒精含量大于或等于20mg/100mL小于80mg/100mL的驾驶行为。350mL(约相称于1小瓶)啤酒或半两白酒(20mL)醉酒驾车：指驾驶员血液中的酒精含量大于或等于80mg/100mL的驾驶行为。1400mL(约相称于3瓶500mL)啤酒或一两半白酒(80mL)C2H5OH+NAD+CH3CHO+NADH醇脱氢酶NADH+[Fe(CN)6]4-NAD++[Fe(CN)6]3-+H++e-61（二）电位型酶电极电位型酶电极是将酶促反应所引起的物质量的变化转变成电位信号输出，电位信号大小与底物浓度的对数值呈线性关系。电位型酶电极所用的基础电极是对某种离子有选择性或对气体有选择性的电极离子选择性电极气敏电极631773年，伊莱尔·罗埃尔（HilaireRouelle）发现尿素。1828年，德国化学家弗里德里希·维勒首次使用无机物质氰酸氨（由氯化铵和氯酸银反应制得）与硫酸铵人工合成了尿素。弗里德里希·维勒（FriedrichWohler）⑴尿素电极尿素的分子模型增高：急性或慢性肾小球肾炎、肾功能衰竭、尿路阻塞、尿路肿瘤、高蛋白质饮食等。减低：妊娠后期、蛋白质摄入不足、营养不良等。66尿素在脲酶作用下发生水解反应可用氨气敏电极、二氧化碳电极等作为基础电极测定尿素的含量。22232(NH)CO+HO2NH+CO脲酶（2）草酸电极草酸（乙二酸）结构式♫维生素C代谢♫甘氨酸代谢♫草酰乙酸水解♫异柠檬酸降解♫食物摄入：菠菜、茶叶生物体内草酸的来源：草酸草酸脱羧酶2CO2+甲酸（3）腺苷电极♫参与心肌能量代谢♫扩张血流量♫合成ATP、腺苷酸的重要中间体腺苷腺嘌呤脱氨基酶肌苷+NH3（4）苯丙氨酸电极♫哺乳动物的必需氨基酸♫是甜味剂阿斯巴甜的主要原料苯丙氨酸苯丙氨酸胺裂解酶反式肉桂酸盐+NH3734.2酶场效应晶体管传感器(ENFET)ENFET将酶膜复合在ISFET的栅极。测量时，酶的催化作用使待测分子反应生成ISFET能够响应的离子。ISFET工作原理75敏感膜与溶液界面产生膜电位，该电位叠加在栅压上，引起场效应管漏电流的变化。根据能斯特方程，膜电位的大小与溶液中的离子活度有关，即:76（一）葡萄糖-FET葡萄糖-FET是由对H+敏感的ISFET和固定在其栅极上的葡萄糖氧化酶膜构成的。61262261272222CHOHOOCHOHO葡萄糖氧化酶77酶催化底物反应时，生成葡萄糖酸根、H+和过氧化氢，导致酶膜附近pH值变化，且pH的变化量与葡萄糖含量有关。溶液中H+的浓度变化，离子敏感膜与溶液界面的膜电位发生变化，该电位叠加在栅源电压上，栅源电压的改变与溶液中pH值的变化量成线性关系。葡萄糖-FET工作原理：为提高葡萄糖-FET的工作性能和测量精度，可采用两个pH敏感的场效应管构成差动式结构。双栅极酶-FET传感器79一个FET的栅极固定葡萄糖氧化酶膜，作为工作FET；另一个FET的栅极上没有酶膜，作为参比FET。将2个FET接到差动放大器上，干扰因素被消除，使输出电压只对葡萄糖响应，因此输出电压的变化能够反应葡萄糖含量的变化。80（二）尿素-FET尿素-FET是由H+-ISFET和脲酶膜组成，其原理是利用pH-FET检测脲酶水解尿素时溶液pH发生的变化。22223()2CONHHOCONH脲酶2HO2HO3HCOH422NHOH