液相色谱之线性关系考察(标准曲线)

标准曲线知识（液相色谱中通常说的线性关系）针对很多研究生对液相色谱之线性关系考察一知半解，只知道要做这个，为什么要做？怎么做？怎么分析？等等，并不清楚，下面采用示例做一个讲解。示例：标准品浓度梯度与相应的峰面积浓度梯度峰面积01002299450167028904101105121310141509161690181852201911222002线性关系考察1图1从低到高前7个数据线性图y=100.8x+98.179R²=1050010001500051015峰面积浓度梯度线性关系考察2从低到高前8个数据线性图线性关系考察3从低到高前9个数据线性图线性关系考察4从低到高前10个数据线性图y=100.79x+98.25R²=10500100015002000051015峰面积浓度梯度y=100.09x+101.49R²=0.9999050010001500200005101520峰面积浓度梯度y=98.697x+108.93R²=0.9994050010001500200005101520峰面积浓度梯度线性关系考察5从低到高前11个数据线性图线性关系考察6、图6从低到高前12个数据线性图以上6个图均是基于表中数据所做的线性关系图。解说：1.图6中的公式y=90.642x+160.03：X指浓度，Y指在某液相条件下，当浓度为X时的峰面积，他们的关系满足y=90.642x+160.03这个公式。当X为0时（空白）峰面积为160.03，为1时峰面积为160.03+90.642，依此类推。y=94.791x+132.36R²=0.9944050010001500200025000510152025峰面积浓度梯度y=90.642x+160.03R²=0.9884050010001500200025000510152025峰面积浓度峰面积R²指相关系数，即浓度与峰面积的相关性，即峰面积是否随浓度的增加而增加，如果浓度增加1倍，峰面积也增加1倍，则他们完全相关；如果峰面积与浓度的增加没有规律，则他们不相关。R²在0~1之间，为0时完全不相关，为1时完全相关，越高，相关性越高，方法越好。一般来说，液相线性关系要满足4个9，即R²≥0.9999，有些特别难测的，可以为0.999。2.以上6个图显示，图1至图3较好的满足了线性关系，但随着浓度的增加，线性关系破坏（图4至图6），浓度的增加，并没有使峰面积增加相应的倍数。说明一个问题，仪器测量是有一个浓度范围的（所有仪器都一样），超过一定范围，线性关系就不存在了，浓度与峰面积之间失去了其相关性，所测数据用线性关系来衡量就会不准确。PS：液相色谱的外标法（外标一点和标准曲线法）均是基于线性关系来计算的，外标一点法计算方法为样品浓度（X样）/标准品浓度（X标）=样品峰面积（Y样）/标准品峰面积（Y标），当标准品浓度X标及2个峰面积Y样和Y标都知道时，就可算出样品浓度X样，但线性关系不存在时，外标法就不准确了。所以，我们所测得的样品浓度一定要在线性关系范围内，超过就不准确了。3.线性关系是用来衡量液相色谱仪上机条件（柱温、流速、流动相等）的准确与稳定如否，以及衡量线性范围（什么范围内呈线性关系，上限是多少）的，他只与标准品及其浓度及上机条件有关，与做样品测定的提取条件等毫无关系，也就是说标准曲线是独立测定的，不与你的样品提取条件有关。但标准曲线相当于参照物，它是衡量样品浓度的标准，所以，上机方法一旦确定，不管什么时候测线性关系，这个关系都客观存在的（理论上讲，不同环境条件下，同样的上机条件，标准曲线的截距和斜率是有差异的。但由于液相色谱仪的先进性使得其能够控制上机环境条件，线性关系变化不会很大，只要测定时有对照品浓度做对照，使用外标一点法也可以相对准确的测定样品浓度，因此没必要每次都做线性考察。PS：相对来说，分光光度法是每次测定都应该做线性考察的。）由于线性关系是衡量这个方法的可行性的，肯定要在最前面进行测定，上机条件一确定就得测，而不是等单因素试验、正交试验甚至批量样品试验都做完了才测。等这些做完了再测，万一线性关系不好或者这些试验的浓度过高超过线性范围了，那所测得的数据就是不准确的，那得全部重做。4.所以，当做提取溶剂及提取方法等其它单因素试验，出现不同的处理峰面积不同时，只要有一个处理的峰面积超过了线性关系浓度上限的峰面积，就得降低样品的浓度（少称样，或者加大稀释倍数），不用管那些低浓度的，因为线性是有一个范围的，通常较低浓度的一般都在线性范围内（当然，也不是越低越好，原则是要在线性范围内）。（如果只是某个处理如某溶剂的峰面积超限，也可以只降低那一个处理的浓度，因为它的稀释倍数高一些，最终的含量是不会变的。一般来说，样品的浓度在线性范围的中间部分是最好的）。总言之，只有测定样品的浓度在线性关系浓度范围内，测得的数据才有意义，否则是不准确的。上限浓度的确定：对照示例，多做几个标准品梯度，从较低的几个浓度开始，逐步做线性关系考察，就能知道线性关系的上限。用上限浓度做对照，所测样品的峰面积不高于上限标准品浓度的峰面积就行。做线性关系时要有一个空白对照（标准品浓度为0），空白对照指单单使用标准品的溶剂，而没加标准品（不是测定样品的提取液，是标准品溶剂，如标准品用甲醇溶解就用甲醇做空白。即空白对照的溶济要与标准品使用的溶剂完全一样）。当然，样品测定时则用提取液做空白。