免疫荧光实验步骤大全(精华版)

免疫荧光染色大全（精华版）组织免疫荧光法（1）将待染组织切片置于65摄氏度恒温箱烤片1h，脱蜡（2）1×PBS洗涤3次，每次5min。（3）0.5%TritonX-100（PBS配制）室温通透10min（4）1×PBS洗涤3次，每次5min。注意：步骤（3）和（4）用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原直接跳过此步骤（5）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火3min，后转成低火15min。（6）1×PBS洗涤3次，每次5min。（7）3%H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。（8）1×PBS洗涤3次，每次5min。（9）使用1%BSA进行室温封闭30min，用于封闭非特异性抗原表位。（10）按抗体推荐使用说明书孵育特异性一抗，4°C湿盒中静置过夜。（11）次日取出切片，室温下复温30min。（12）1×PBS洗涤3次，每次5min。（13）选取相应的免疫荧光二抗滴加于血管组织上，37°C避光孵育30min。（14）1×PBS洗涤3次，每次5min。（15）避光条件下，DAPI染液染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用（16）1×PBS洗涤3次，每次5min。（17）在血管组织上滴加抗荧光淬灭剂进行封片。（18）使用荧光显微镜进行观察拍照。贴壁细胞免疫荧光法（1）在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3min（2）4%多聚甲醛固定细胞爬片15min（3）1×PBS洗涤3次，每次5min。（4）0.5%TritonX-100（PBS配制）室温通透10min（5）1×PBS洗涤3次，每次5min。（6）1%BSA室温封闭30min（7）弃掉封闭液，细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗，4℃孵育过夜（8）1×PBS洗涤3次，每次5min。（9）细胞爬片滴加稀释至适当比例的荧光二抗（10）1×PBS洗涤3次，每次5min。（11）DAPI染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用（12）1×PBS洗涤3次，每次5min。（13）用抗荧光淬灭剂封片（14）荧光显微镜下观察采集图像细胞免疫荧光（悬浮细胞方法一）（1）收集悬浮细胞，细胞在冰浴中冷却，然后用台式离心机于4℃以800g离心5min，吸去培养液并以4℃1×PBS重悬细胞。（2）离心吸去PBS，4%多聚甲醛固定液，重悬细胞，置冰上固定30min。（3）离心、吸去固定液，用4℃1×PBS重悬细胞，离心800g离心5min，去PBS，留细胞沉淀。（4）0.5%TritonX-100（PBS配制）室温通透10min（5）离心800g离心5min，去通透液，留细胞沉淀。注意：步骤（4）和（5）用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原直接跳过此步骤（6）使用1%BSA进行室温封闭30min，用于封闭非特异性抗原表位。（7）离心800g离心5min，去封闭液，留细胞沉淀。（8）孵育一抗，浓度根据抗体说明书操作，4℃摇床孵育过夜（一般孵育15-16h）（9）用4℃1×PBS稀释细胞和抗体，离心，吸去PBS，以4℃1×PBS重悬细胞，重复1次。（10）吸去PBS，二抗孵育液（二抗浓度根据抗体说明书操作）重悬细胞，4℃温育30-60min，重复步骤（9）（11）避光条件下，DAPI染液染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用（12）重复步骤（9）（13）用少量的PBS重悬细胞，然后用吸管铺到载玻片上，用盖玻片覆盖。（14）使用荧光显微镜进行观察拍照。细胞免疫荧光（悬浮细胞方法二）（1）悬浮生长细胞：取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm，5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。把细胞片浸入95％乙醇或丙酮中固定。（2）1×PBS洗涤3次，每次5min。（3）0.5%TritonX-100（PBS配制）室温通透10min（4）1×PBS洗涤3次，每次5min。注意：步骤（3）和（4）用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原直接跳过此步骤（5）使用1%BSA进行室温封闭30min，用于封闭非特异性抗原表位。（6）按抗体推荐使用说明书孵育一抗，4°C湿盒中静置过夜。（7）次日取出细胞片，室温下复温30min。（8）1×PBS洗涤3次，每次5min。（9）选取相应的免疫荧光二抗滴加于细胞片上，37°C避光孵育30-60min。（10）1×PBS洗涤3次，每次5min。（11）避光条件下，DAPI染液染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用（12）1×PBS洗涤3次，每次5min。（13）在细胞片上滴加抗荧光淬灭剂进行封片。（14）使用荧光显微镜进行观察拍照。