Trizol中文说明书

Trizol中文说明书TRIzol试剂是一种从组织及细胞中提取总RNA的专用试剂。这种试剂是一种酚和硫氰酸胍的单相溶液，是将Chomczynski和Sacchi发明的一步RNA提取法的改进。在样品匀浆或分析过程中，TRIzol试剂可在分裂细胞及溶解胞膜的同时保持RNA的完整。在匀浆后加入氯仿，可将溶液分为水相和有机相。RNA均在水相中。吸取水相加入异丙醇，得到RNA沉淀。去除水相后，样品中的DNA及蛋白质可通过进一步连续的沉淀而得到。中间相加入乙醇可沉淀DNA而有机相加入异丙醇则能沉淀出蛋白质。DNA的再纯化可能对标化样品的RNA产量有作用。2．这一技术可以用于人，动物，植物或细菌株的微量组织（50—100mg）及细胞（5×106），也可以用于大量检材（≥1g）及细胞(﹥107).该方法简便易行,可用于同时检测大量样品,全部过程1小时内可以完成.用TRIzol试剂分离的RNA没有DNA及蛋白质成分.这种RNA可用于Northern印迹分析,斑点杂交,多聚(A)+检出及Vitro转移,RNA酶蛋白分析及分子克隆.用于PCR反应时,当两个引物位于同一外显子时应用扩增特异DNA酶I处理提取出的RNA.3．TRIzol试剂可用于分子量从大到小的各种RNA的提取.例如,大鼠肝脏提取出的RNA,经琼脂糖凝胶电泳,EB染色后可显现出7kb和15kb的大分子量的RNA谱带(包括mRNA和hnRNA),位于～5kb(28s)和～2kb(18s)的两条主要的核糖体RNA谱带及大小在0.1kb-0.3kb之间的低分子量RNA(tRNA,5s).分离出的RNA当溶于双蒸水中时A260/280为1.6-1.8之间.每毫克组织所能提取的RNA量约为:肝和脾,6-10μg;肾,3-4μg;骨骼肌和脑,1-5μg;胎盘,1-4μg.从1×106培养细胞中提取的RNA量约为:上皮细胞,8-15μg;成纤维细胞,5-7μg.需要但未提供的试剂:1.氯仿2.异丙醇3.75%乙醇(DEPC处理水配制)4.无RNA酶水或0.5%SDS溶液(制备无RNA酶水:将水倒进无RNA酶的玻璃容器中,加入DEPC至0.01%(v/v)放置过夜后高压灭菌).SDS溶液必须用DEPC处理后高压灭菌的水配制.RNA分离提取步骤:1．匀浆a.组织每50-100mg组织加入1ml的TRIzol试剂后用匀浆机或玻璃棒匀浆。样品的体积不要超过匀浆使用的TRIzol试剂体积的1/10。b.单层培养细胞在一个直径3.5cm的培养皿中加入1mlTRIzol试剂来溶解细胞，用移液器反复吸打细胞溶液。加入的TRIzol试剂的量取决于培养皿的表面积（每10cm2加入1ml）而不是取决于细胞的数目。如果TRIzol试剂的量不足，提取的RNA中会混有DNA。c.悬液中培养细胞离心沉淀细胞，吸取细胞，反复吹打使溶解于TRIzol试剂中。每5～10×106个动物，植物或酵母细胞，每1×107个细菌细胞加入1mlTRIzol试剂。应该避免在加入TRIzol试剂前洗细胞，因为会增加mRNA的变性。破坏某些酵母或细菌细胞需要使用匀浆机。2．选择采用的步骤：对于含有大量蛋白质，脂肪，多糖或其他细胞外物质的样品如肌肉，脂肪，植物的块茎等可能需要再加上一个步骤。匀浆后，2℃～8℃条件下12，000×g离心10分钟去除不溶物质。沉淀中包含有细胞外膜，多糖，大分子量DNA，RNA在上清中。来源于脂肪组织的样品，最上层是脂肪层应该弃去。在每一种情况下，将纯净后的匀浆溶液放在一新管里，加入氯仿即可以有如后面所描述的分层。3．有机相与无机相的分开将匀浆后的样品在15℃～30℃孵育5分钟使核酸蛋白质混合物分裂彻底。每1mlTRIzol试剂加入0.2ml氯仿。小心盖上离心管盖，用手剧烈振摇15秒，15℃～30℃孵育2～3分钟。2℃～8℃条件下，以低于12，000×g离心15分钟。样品分成几层，最下层红色的酚-氯仿层，中间层及无色的上层水相。RNA均在水相中。水相的体积约是用于匀浆的TRIzol试剂体积的60%。4．RNA沉淀将水相转移至一个新试管中，如果需要提取DNA或蛋白质可以保存有机相。用异丙醇从水相中沉淀RNA。匀浆时每使用1ml的TRIzol的试剂加入0.5ml异丙醇沉淀RNA。样品在15℃～30℃孵育10分钟后，2℃～8℃条件下，以低于12，000×g离心10分钟。离心后RNA沉淀通常即可见到，在管底或管壁上形成了胶样的小团块。5．RNA洗涤弃去上清，用75%乙醇洗涤RNA沉淀一次，匀浆时每使用1ml的TRIzol试剂至少加入1ml75%乙醇。涡旋混匀样品，2℃～8℃条件下，以低于7，500×g离心5分钟。6．RNA的再溶解在步骤最后，暂短干燥RNA沉淀（空气干燥或真空干燥5-10分钟），不要在真空下离心干燥RNA。很重要的一点是，不要让RNA团块完全干燥，因为这会大大降低其溶解性。不完全溶解的RNAA260/280＜1.6。用无RNA酶水或0.5%SDS溶液溶解RNA，可以用吸头反复吹打，55℃～60℃孵育10分钟（当RNA用于酶学反应时不用SDS）。RNA也可用100%formamide（去离子）溶解储存于-70℃。DNA提取步骤在水相被完全吸取后，正如在RNA分离步骤中所述一样，最初离心后在中间相和酚相中的DNA可以被提取。在沉淀及洗涤后，DNA溶于8mMNaOH。TRIzol试剂可以用于从组织及培养细胞中分离DNA并分析样品中DNA含量的实验，同时，提取基因组DNA可以用于Northern分析的标化，这是因为可以用每个基因组DNA替代更容易变化的总RNA或组织重量。（根据来源不同，在下一步反应前有些获得的DNA沉淀可能需要进一步纯化。需要但未提供的试剂1．乙醇2．溶于10%乙醇中的0.1M柠檬酸钠3．75%乙醇4．8mMNaOH步骤：1．DNA沉淀弃去在中间相上残存的水相，用乙醇沉淀中间相和水相中的DNA。匀浆时每使用1ml的TRIzol试剂加入0.3ml100%乙醇，颠倒混匀样品。将样品在15℃～30℃放置2-3分钟后，2℃～8℃条件下，以低于2，000×g离心5分钟沉淀DNA。（小心弃去水相对提取的DNA的质量十分关键）2．DNA洗涤弃去酚-乙醇组成的有机相上清，如果需要，则保留此上清用于提取蛋白质。用溶于10%乙醇的0.1M柠檬酸钠溶液洗涤DNA沉淀两次。匀浆时每使用1ml的TRIzol试剂，加入1ml上述溶液。每次洗涤时，使DNA沉淀在洗涤溶液中室温（15℃～30℃）30分钟（隔一段时间混匀一次），2℃～8℃条件下，2，000×g离心5分钟。洗涤两次后，将DNA团块置于75%乙醇（每1ml的TRIzol试剂加入1.5-2ml75%乙醇）室温放置10-20分钟（隔一段时间混匀一次）之后，2℃～8℃下，2，000×g离心5分钟。（如果DNA团块很大，含有＞200μgDNA或大量非DNA组成，可以多用溶于10%乙醇的0.1M柠檬酸钠溶液洗涤一次）3．DNA的再溶解打开管盖，空气中干燥DNA5-10分钟（不要离心条件下干燥，否则极难溶解）。将DNA溶于8mMNaOH中，DNA浓度为0.2-0.3μg/μl。例如，对从107细胞或50-70mg组织中提取的DNA加入300-600μl的8mMNaOH溶解。由于提取的DNA在水或Tris缓冲液中溶解不好，所以需要将其溶于弱碱溶液中。8mMNaOH的pH值约为9，DNA一旦溶于其中其pH值很容易用TE或HEPES来校准。这一步中，DNA沉淀（尤其来源于组织的DNA）可能带有不溶性的胶状物（碎片或细胞膜等）。大于12，000×g离心10分钟去除不溶物。将含有DNA的上清液移至一个新管中。溶于8mMNaOH的DNA在4℃可以稳定保存几个月，在-20℃可以保存一年以上，在-70℃则可以长期保存。DNA的产量取出一定量溶解在8mMNaOH的DNA，用水稀释混匀后测定上述溶液的A260值。用双链DNA的A260值计算DNA含量。一单位A260相当于每毫升含50微克双链DNA。当计算被检测样品中的细胞数目时，假定人，大鼠及小鼠的每1×106个双倍体细胞中所含DNA量分别为7.1μg,6.5μg,5.8μg。每mg组织中DNA的量约为：肝及肾，3-4μg；骨骼肌，脑及胎盘，2-3μg。来源于人，大鼠及小鼠的每1×106个培养细胞中DNA的量约为5-7μg。用途PCR扩增用DNA将DNA溶于8mMNaOH后，用0.1MHEPES调节pH值到8.4。在PCR反应液中每管加入0.1μg至1.0μg的DNA样品后进行标准PCR程序。限制性核酸内切酶反应讨论结果：TRIzol能同步抽提RNA和DNA；其中RNA的质量很高，而DNA用于某些实验是需要进一步纯化的。基本上，TRIzol抽提的DNA，蛋白质残留是比较多的，所以比值低。按照标准操作，无论怎么仔细，结果都差别不大，这是Tizol方法上的问题。