果蝇的昼夜生物钟基因及其作用机理

果蝇的昼夜生物钟基因及其作用机理摘要：昼夜节律生物钟是一种以近似24小时为周期的自主维持的振荡器，由输人通路、中央振荡器和输出通路三部分组成的。生物钟机制的研究已深入到分子水平。生物钟相关基因相继被分离鉴定，它们及其编码的蛋白质产物构成的自主调节的转录和翻译反馈环是生物钟运转的分子机制。本文介绍了果蝇主要生物钟基因及其作用机理，展望了揭示生物钟调节机制在遗传学上的重要意义。关键词：昼夜节律生物钟，生物钟基因，分子机制Abstract:Thecircadianclockisaself-sustainingoscillatorwithaperiodofabout24hourthatincludesinput,centraloscillatorandoutput.Thecircadianclockmechanismhasbeenstudiedextensivelyatthemolecularlevelandseveralclock-relatedgeneshavebeenidentified.Theclockgenesandthecodedproteincomprisetheself–sustainingfeedbackloopthatcanregulatebothonthetranscriptionalandonthetranslationallevel.Thisarticleintroducedtheclockgenesandmolecularcircadianmechanismfoundindrosophilam.Thesignificanceofthecircadianclockregulationmechanismresearchingeneticswasalsoprospected.Keywords:circadianclock,Clockgene,Molecularcircadianmechanism生物钟是基因和行为之间的联系的一个强有力的例证，它也揭示了环境对基因表达的影响，表现了遗传和外界因素的相互作用决定有机体外在的行为。生物钟是许多有机体所固有的，从细菌到人类，这或许是由于有机体长期接受光照和黑暗循环的进化结果。最初人们猜想生物钟可能是因为有机体对每天昼夜变化的反应，白天寻找食物，晚上休息。但是实验证明生物体在没有任何环境变化的条件下仍表现出以24小时为一周期的有节律的行为。生物钟能够使生物体本身的节律与环境的节律同步化，因此生物钟可以优化生物体日常行为的节律，并且生物钟确实影响机体的健康[1,2]。昆虫经过长期的演化，在它们的生命活动和行为中，有着明显的昼夜节律性周期变化。许多昆虫的活动节律还有季节性，对于一年发生多代的昆虫，各世代在滞育、迁移、交配、生殖等方面对季节性昼夜变化有明显的反应。这些周期性节律活动，主要受光周期、温度等外在因子和内在神经-内分泌物(诸如各种激素)的调节和控制。昆虫的生物钟种类很多，本文详细介绍果蝇的昼夜节律生物钟[3]。昼夜钟可分3个部分：(1)生物振荡器(oscillator)，由一组呈节律表达的基因及其编码的蛋白质组成。节律基因启动后，经转录、翻译生成相应的蛋白质。当此蛋白质浓度达到一定程度，反馈作用于自身基因的启动部位，使其浓度高低以24小时周期进行振荡[4]。在昼夜振荡反馈回路中，正性成分(positiveelement)，启动生物钟基因，使之进行表达；负性成分(negativeelement)，阻断正性成分的作用，使表达减弱或停止[5]，如图1所示。振荡器是生物钟运作的核心元件，它收外界传入的信号，引起相应的基因表达，进而控制钟信号的输出路径，使生物体展现昼夜节律活动；(2)输入系统，接受环境周期信号传入到振荡器，调节相关基因的表达，矫正节律位相，由感受器和传入路径组成。最重要的授时因子(Zeitgeber)为光-暗和温度；(3)输出系统，包括与信号输出有关的钟基因和一些钟控基因(clock-controlledgenes,CCG)，将母钟节律振荡信号，经体液和神经途径送达效应器，调节其生理、生化和行为的昼夜节律[6]。图1生物钟基因反馈调节示意图Fig.1Aschemeofautoregulatorybiologicalclockgene1果蝇的昼夜生物钟基因黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)是研究昼夜生物钟的重要模式生物，其蛹的羽化和成虫的行为活动均呈现昼夜节律性。果蝇类钟基因的研究上世纪70年代初已开始，积累资料颇丰。它的主钟由位于脑部的两簇神经元组成，位于脑部。以后研究发现，在其身体其他组织亦有钟结构。到现在为止，在果蝇上已经发现了7个基因主要参与中枢钟的调节，它们是：period(per),timeless(tim),clock(clk),cycle(cyc),vrille(vri),double-time(dbt)和Crypto-chrome(cry)[7]。1.1per基因per是1993年首次被鉴定和克隆成功的钟基因，长10kb，可编码1200氨基酸的蛋白质，其中一个氨基酸被取代，就会使周期和转录循环发生改变。per缺陷可改变生物节律。业已证实，它有3个变异的等位基因：长周期基因、短周期基因和无周期基因，分别使果蝇的周期长度变为28小时、19小时或无节律。我们现在对昼夜钟的认识是从per的结构、调节和产物开始的[8]。per是果蝇的主控基因，影响昼夜节律和超日节律。per经转录和翻译后，形成PER蛋白，组成钟的反馈回路。但其须与另一种钟蛋白组成异二聚体后，才能作为负性成分发挥作用[9]。per可在果蝇成虫的眼、触角、脑(神经元和胶质细胞)、胸神经节、唾腺、卵巢、消化道和马氏管等许多组织中表达[3]。在permRNA中部有一个编码约20对苏氨酸—甘氨酸重复(TG重复)的区域。TG的缺失对昼夜节律并不产生影响，但却使果蝇的求偶鸣声节律变慢[3]。per上游有一段69bp的增强子序列，其中的E-box(enhancer)是permRNA高水平表达所必需的。1.2tim基因永恒基因tim是果蝇的第二个生物钟基因，它对per进行转录后调节，在细胞核内定位和蛋白质稳定性等方面起作用[10]。tim基因是在无明显昼夜节律的果蝇pero中发现的，并已证明是果蝇昼夜节律功能所必需的，其翻译产物TIM是一种酸性蛋白质，N端含有核定位序列(信号肽)，C端富含酸性氨基酸，具有转录活化结合结构域。从果蝇中分离到的一种蛋白激酶基因产物DBT，一方面使PER不稳定，另一方面使磷酸化后的PER与TIM结合形成稳定异二聚体[11]。per和tim在下午提高转录水平，黄昏时mRNA达高峰，PER和TIM蛋白的积累峰在6小时后出现，二者形成异二聚体进入核内，作为负性成分发挥作用。黎明后光使TIM降解，致使PER不稳定，导致PER∶TIM对CLOCK∶CYC的抑制作用降低，开启新一轮的循环。时间生物学研究表明，光—暗周期可导引昼夜节律使其位相重调。在黑夜的早期给果蝇光照，使昼夜周期延长，由于此时tim的mRNA处于高峰期稳定，TIM被光解后可能迅速被新合成的TIM替补，系统推迟节律后再回到光照前的位点上；在夜间晚期给予光照，昼夜节律缩短，这可能由于大TIM被光降解，此时正处于节律的低谷期，很少或无timmRNA替补之故。1.3clk基因CLOCK最早是从小鼠中分离出来的生物钟基因产物，是由Clock编码的转录因子。结构中含有PAS-bhlh(碱基-螺旋-环-螺旋)结构域，且C端富含具有转录激活作用的Gln(即Q-rich)。1.4cyc基因果蝇的CLOCK和CYC通常以异二聚体形式，发挥正性调节作用。per和tim两种基因启动子的E-box是其作用的目标靶。CLOCK∶CYC异二聚体，激活per、tim基因转录，生成PER和TIM两种蛋白。而且也激活vri、pdf、ccg等基因生成蛋白质或引起相应生物学效应[12]。1.5dbt基因dbt基因产物DBT是一种蛋白激酶，在细胞质内对PER进行磷酸化，使其稳定性降低，从而易于与TIM结合。二者结为异二聚体后性能稳定，进入细胞核[12]。1.6vri基因果蝇昼夜生物钟vri基因的作用现在还难以确定。它是在分离野生型和无节律型per01基因突变体的不同转录本时发现的。测序发现它是一个已知的编码bZip转录因子的基因，对于生长发育有重要的作用。vri的mRNA周期表达随per/tim基因表达水平而改变，并受CLOCK/CYC与E-box结合的调节。反过来，在表达tim基因的细胞中，vri基因的持续活化可抑制per和tim基因的转录。vri基因的长时程表达可经转录后调节机制降低PDF的水平，而PDF水平的下降可能是果蝇长周期及无节律表型增加的原因。在这些表型突变的果蝇中，已发现vri基因的水平是恒定的。vri基因的mRNA在果蝇腹部神经元(LNs)和光受体细胞上进行表达，其产物VRI可能是生物振荡器的中心成分之一。VRI一旦被破坏，可以打破其他基因产物如TIM等的正常循环[13]。1.7cry基因隐色素(Cryptochrome,CRY)是由cry基因编码的一种对蓝光极为敏感的黄素蛋白光受体。作为光受体,接受光波并将其传递到振荡器的钟基因。首先在拟南芥中分离鉴定，能介导拟南芥的生长、开花时间和向光[14]。1996年克隆出了哺乳动物的同源蛋白mCRY，并发现mCRY蛋白也作为感光受体表达于哺乳动物的视网膜内核层中，它在光信号转导中起重要的作用。果蝇的cry基因突变成cryb后，突变体果蝇脑的昼夜钟表现正常，但外周钟则变的无节律，这种现象提示中枢钟与外周钟的机制不同[15]。Fernanda等研究表明[16]，CRY接受光信号刺激后，发生光化学变化，在胞浆和细胞核中直接与TIM发生光依赖性结合，促使PER/TIM复合物失活，从而终止其在反馈环路中的作用。果蝇的光受体除了CRY之外，神经元的振荡器还可能从其它输入途径获得光信号。隐色素开始是作为一种植物光受体，后来又在动物中找到了它的同源基因，这是为数不多的从植物到动物神经系统之间的进化联系，未来的研究需着眼于果蝇与哺乳动物CRY的不同功能。2果蝇昼夜节律调节的分子机制果蝇的昼夜节律，在蛹期是测定种群中个体之间羽化高峰的小时数，在成虫期则是测定个体静止/运动周期的时间。目前认为，果蝇生物钟节律的起搏点是一种“转录—翻译—抑转录”机制构成的反馈环路。此反馈环的具体作用方式如图2。TIM通过与PER的异型结合，调节PER进入核的时间进而调节昼夜节律行为。但是两者都不具有DNA结合活力，因此，PER可能通过其PAS域或之外的区域与其他含有bHLH-PAS域的生物钟基因结合，来进行负反馈调节。最近发现，per上游的增强子序列中的1个E-box(enhancerbox)是perRNA高水平表达所必需的。而tim的E-box的作用方式有所不同，它需和上游相邻的顺式作用因子结合在一起，进而促进timmRNA的高水平表达；同时，E-box还是bHLH异型二聚蛋白的结合部位。而在此机制中恰好有2个含有bHLH-PAS域的转录因子CLOCK和CYCLE，两者之间通过它们的PAS域相互作用，形成CLOCK-CYCLE异二聚体结合到per和tim的E-box增强子上，分别驱动per和tim的表达。随着PER和TIM的积累并进入核内，它们与dCLOCK-CYCLE相互作用导致异二聚体改变构象或者掩盖它的结构域，进而阻遏CLOCK-CYCLE与E-box的结合，消减了per和tim的转录；与此同时，通过一个独立的激活因子或激活因子复合物又可以促进dClk的转录。与之相对应，在缺少PER-TIM的情况下，高水平的dCLK-CYC可以激活per和tim的转录，同时抑制dClk的转录，其作用方式可能是直接或间接的，这样就形成了2个相互调节的反馈环，从而驱动果蝇生物节律内部生物钟的正常运转。这个生物钟再经过一些尚未知的调节蛋白质的稳定性及磷酸化的蛋白的放大作用，而使生物体具有节律性。此回路中的DBT(dou